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外泌體相關(guān)研究文獻分享,輕松讀完一篇文獻（九）: 領(lǐng)取紅包 (小木蟲手機app專屬紅包)

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今天分享一篇發(fā)表在PLOS Biology（2021年IF=8.029）上的文章，名為《Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles》[1]（神經(jīng)干細胞通過細胞外囊泡運輸功能性線粒體）。

神經(jīng)干細胞移植誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病動物模型的恢復(fù)。雖然替代丟失的內(nèi)源性細胞最初被認為是神經(jīng)干細胞移植物的主要恢復(fù)機制，但現(xiàn)在很清楚，移植的神經(jīng)干細胞通過多種機制發(fā)揮作用，包括通過細胞外囊泡將治療性物質(zhì)橫向交換給宿主細胞。細胞外囊泡是運輸核酸、蛋白質(zhì)、代謝物和代謝酶、脂質(zhì)和整個細胞器的膜顆粒。然而，這些物質(zhì)的功能和對神經(jīng)干細胞廣泛治療效果的貢獻還有待充分了解。線粒體功能障礙是幾種炎癥性和退行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的既定特征，其中大多數(shù)可以用外源性干細胞療法治療。在此，我們研究了神經(jīng)干細胞通過內(nèi)皮細胞釋放和運輸功能性線粒體以恢復(fù)靶細胞線粒體功能的假設(shè)。非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)顯示，腸上皮細胞中神經(jīng)干細胞自發(fā)釋放的線粒體蛋白質(zhì)顯著富集。形態(tài)學(xué)和功能分析證實了EVs內(nèi)存在超微結(jié)構(gòu)完整的線粒體，具有保守的膜電位和呼吸。我們發(fā)現(xiàn)這些線粒體從EVs轉(zhuǎn)移到mtDNA缺陷型L929 Rho0細胞挽救了線粒體功能，并且增加了Rho0細胞的存活率。此外，將來自EVs的線粒體摻入炎性單核吞噬細胞恢復(fù)了正常的線粒體動力學(xué)和細胞代謝，并降低了靶細胞中促炎性標記物的表達。當移植到多發(fā)性硬化動物模型中時，外源性神經(jīng)干細胞主動將線粒體轉(zhuǎn)移到單核吞噬細胞，并誘導(dǎo)臨床缺陷的顯著改善。我們的數(shù)據(jù)提供了第一個證據(jù)，表明神經(jīng)干細胞通過內(nèi)皮祖細胞向靶細胞遞送功能性線粒體，為開發(fā)新的方法鋪平了道路，該方法旨在恢復(fù)多發(fā)性硬化以及退行性神經(jīng)疾病中的線粒體功能障礙。

研究過程：

一、細胞外囊泡和外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定線粒體蛋白質(zhì)

首先對全EV部分和蔗糖梯度純化的外泌體進行了基于非靶向多重TMT的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，這些外泌體由神經(jīng)干細胞在體外自發(fā)釋放，并將其與親代神經(jīng)干細胞全細胞裂解物進行了比較。

使用基因本體細胞成分(GOCC)注釋，研究與神經(jīng)干細胞相比，富含EVs的蛋白質(zhì)的亞細胞起源。發(fā)現(xiàn)帶有指示外體定位的注釋的蛋白質(zhì)在EVs中顯著富集，而帶有指示核定位的注釋的蛋白質(zhì)則缺乏。有趣的是，與神經(jīng)干細胞相比，帶有線粒體定位注釋的蛋白質(zhì)在內(nèi)皮細胞中也顯著富集。

為了進一步研究后一個發(fā)現(xiàn)，接下來用特定的GOCC子注釋檢查了數(shù)據(jù)，表明定位于3個主要的線粒體結(jié)構(gòu)成分：外膜、內(nèi)膜和基質(zhì)。與神經(jīng)干細胞相比，具有這些注釋的蛋白質(zhì)在內(nèi)皮細胞中相對富集。還特別檢查了5個線粒體復(fù)合體亞單位的相對豐度，發(fā)現(xiàn)線粒體和核基因組中編碼的線粒體蛋白質(zhì)在EVs中都顯著富集。然后研究了EVs的DNA含量，發(fā)現(xiàn)在mtDNA中編碼的線粒體基因NADH脫氫酶亞基1(mt-ND1)存在于EVs中，而不管它們是否用DNase I預(yù)處理。然而，在核DNA中編碼的線粒體基因琥珀酸脫氫酶復(fù)合物亞基D(Sdhd)并非如此，因此表明核DNA沒有富集，而EVs中可能存在線粒體基質(zhì)完整的線粒體。

為了進一步驗證基于TMT的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，接下來對EVs和NSCs進行免疫印跡分析。與NSCs相比，EVs富含外體標記物(CD9、Pdcd6ip和Tsg101)和線粒體復(fù)合物，但缺乏高爾基標記物(Golga2)。相反，從神經(jīng)干細胞裂解物獲得的富含線粒體的對照制劑(稱為 Mito)被發(fā)現(xiàn)缺乏CD9并富含Golga2。

為了排除與純化方法相關(guān)的任何潛在偏差，進一步采用了另外兩種高質(zhì)量和可大規(guī)模生產(chǎn)的商品化基于外泌體/EV沉淀的分離方案，避免了超速離心。我們發(fā)現(xiàn)，這些方案產(chǎn)生的EV缺乏Golga2，但富含CD9和線粒體蛋白。

由于已知這些基于沉淀的試劑盒中的大部分也可以同時分離非EV成分，我們隨后試圖使用兩個附加方案進一步分析源自NSC的EV。首先，我們使用免疫介導(dǎo)的EV標記物CD63的分離試劑盒，從而獲得富含CD63的EV部分(EVsCD63_enrich.)，和缺乏CD63的EV部分(EVsCD63_depl.)。我們發(fā)現(xiàn)線粒體復(fù)合蛋白在EVsCD63_enrich.中的表達最高，而對照培養(yǎng)基制劑中沒有EV和線粒體復(fù)合物。其次，由于完整的線粒體通常在0.2-1um之間，我們測試了一種超速離心方案，該方案在EV分離的基礎(chǔ)上增加了0.22um超濾步驟。我們發(fā)現(xiàn)，這個方案，用于排除完整的線粒體(以下簡稱EVsMito_depl.)，導(dǎo)致來自線粒體復(fù)合蛋白的信號強度顯著降低。

接下來，我們將重點放在通過蔗糖梯度分離從EV制劑中分離的外體部分。與親本神經(jīng)干細胞相比，基于TMT的蛋白質(zhì)組學(xué)分析的外泌體的總蛋白質(zhì)組成與EVs相似。然而，與EVs相比，通過額外的純化步驟，一些蛋白質(zhì)在外體中選擇性地缺失。與親代神經(jīng)干細胞相比，外泌體也顯著富含蛋白質(zhì)，GOCC注釋表明定位于線粒體外膜、內(nèi)膜和基質(zhì)。免疫印跡分析證實，對應(yīng)于預(yù)期外體密度(1.13-1.20g/ml)的級分6至9都富含線粒體復(fù)合蛋白。當觀察單個片段的脫氧核糖核酸含量時，我們確認了其中有線粒體基因mt-ND1，但沒有Sdhd基因，這明確證實了NSC外體以及EVs含有線粒體蛋白質(zhì)和mtDNA。總之，這些數(shù)據(jù)表明，無論用于從組織培養(yǎng)基中分離囊泡的方案如何，線粒體蛋白都存在于EV中，這表明存在線粒體片段或由神經(jīng)干細胞脫落的完整線粒體。

二、EV制劑中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能完整的線粒體

使用互補的生物物理和形態(tài)學(xué)方法進一步鑒定神經(jīng)干細胞EV的特征。使用可調(diào)電阻脈沖傳感(TRPS)分析和納米粒子跟蹤分析(NTA)，發(fā)現(xiàn)EV的直徑大約在80nm到150.8nm之間。通過基于透射電子顯微鏡(TEM)的形態(tài)學(xué)分析進一步研究尺寸分布，在平均直徑為350.13nm(±25.70nm)的EVs異質(zhì)性群體中，我們發(fā)現(xiàn)27.81% (±3.54)的顆粒對應(yīng)于平均直徑為695.4nm(±68.47nm)的線粒體樣結(jié)構(gòu)。這一發(fā)現(xiàn)與EV制劑中完整線粒體的存在是一致的。

接下來，通過納米流式檢測技術(shù)（nanoFCM）分析，比較了我們的EV制劑和EVsMito_depl.。發(fā)現(xiàn)在大小介于0.04-1um之間的總EVs中，有33.52% (Q2+Q3) 為MitoTracker red（線粒體染料）陽性。其中，77.6% (Q2/[Q2+Q3])也表達了標準EV標記CD63。相反，EVsMito_depl幾乎完全沒有 MitoTracker red陽性，很可能只包含線粒體蛋白質(zhì)和/或片段。

接下來，我們使用冷凍-透射電鏡結(jié)合免疫金標記(使用與金納米顆粒(NP)結(jié)合的抗體)來識別EV內(nèi)線粒體的存在。在我們所有的粗制EV制劑中都發(fā)現(xiàn)了TOMM20+游離線粒體，當 saponin被用作溫和去污劑以增加抗體滲透性時，我們還鑒定出了具有3種不同膜的TOMM20和CD63雙陽性顆粒�？傊@些方法證實了神經(jīng)干細胞在體外自發(fā)釋放亞微米范圍的EVs，包括游離和包裹的線粒體。

最后，通過分別使用JC1測定法和高分辨率呼吸測定法(HRR)分析電子傳遞鏈(ETC)在維持線粒體跨膜電位和呼吸方面的活性，測試了粗制EV制劑中線粒體的功能。與EVsMito_depl相反，粗EV制劑顯示出對線粒體解偶聯(lián)劑羰基氰化物間氯苯腙(CCCP)有反應(yīng)的保守線粒體膜電位。此外，當線粒體復(fù)合物的底物加入到EV制劑中時，EV抑制了耗氧量。當使用藍色天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(BN-PAGE)測試線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性時，在自然條件下從EVs中分離出完整的蛋白質(zhì)復(fù)合物。這一發(fā)現(xiàn)與CI-CII-CIV的保守催化活性相吻合，表明存在功能完整的線粒體復(fù)合物。

總之，這些發(fā)現(xiàn)表明，神經(jīng)干細胞EVs具有功能性線粒體ETC和氧化磷酸化的潛力。

三、 EV相關(guān)的線粒體恢復(fù)了mtDNA缺乏細胞的營養(yǎng)缺陷

為了研究EVs是否對靶細胞有影響，我們首先準備表達線粒體MitoDsRed熒光報告子( MitoDsRed+NSCs)的NSCs，該報告子穩(wěn)定地標記EVs中完整的線粒體。事實上，線粒體的線粒體靶序列保證了DsRed蛋白僅在那些保存完整膜的線粒體中積累，從而增強了該標志物的特異性。

然后，我們用 MitoDsRed+NSCs產(chǎn)生 MitoDsRed+ EVs，處理使用長期低劑量溴化乙錠導(dǎo)致mtDNA耗竭的細胞。這些 L929 Rho0細胞具有營養(yǎng)缺陷型生長和對細胞外尿苷的依賴性。

在尿苷缺乏的條件下，我們發(fā)現(xiàn)與用富含分離線粒體的制劑( MitoDsRed+Mito)處理的L929 rho 0細胞相比，L929 rho 0細胞在處理后24小時內(nèi)有效地摻入了MitoDsRed+EVs。在處理后5天，雖然只有少數(shù)未經(jīng)處理的L929 rho 0細胞存活于尿苷耗竭，但用MitoDsRed+EVs處理的L929 rho 0細胞顯示出顯著更高的存活率。最后，在處理后16天，我們能夠?qū)τ肕itoDsRed+EVs處理的L929 rho 0細胞的mt-ND3線粒體基因進行測序，這表明(外源性)EV衍生的mtDNA在靶細胞中的有效整合以及對其內(nèi)在線粒體DNA功能障礙進行糾正。

這些結(jié)果表明EV相關(guān)的線粒體能與持續(xù)mtDNA耗竭的靶細胞整合并恢復(fù)線粒體功能。

四、 EV相關(guān)的線粒體整合到單核吞噬細胞的線粒體網(wǎng)絡(luò)中

線粒體功能和免疫代謝指導(dǎo)單核吞噬細胞對炎癥刺激的激活。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)外源性神經(jīng)干細胞移植物具有免疫調(diào)節(jié)功能，并抑制體內(nèi)響應(yīng)內(nèi)源性代謝信號的促炎單核吞噬細胞的激活。因此，為了進一步了解EV在神經(jīng)干細胞免疫調(diào)節(jié)中的作用，我們接下來研究了這些EV是否被運輸?shù)絾魏送淌杉毎⒃诖诉^程中影響其功能。

骨髓來源的巨噬細胞通過被脂多糖(LPS)攻擊，產(chǎn)生反應(yīng)性促炎巨噬細胞(MφLPS)，然后用MitoDsRed+EVs或外泌體處理。與靜息狀態(tài)下的Mφ [61.23% ( ±2.15)]或外泌體刺激的Mφ[3.7%(±0.23)]相比，mφLPS在處理后6小時通過熒光活化細胞分選(FACS)分析顯示更高的MitoDsRed+[97.17% ( ±0.20)]。這一發(fā)現(xiàn)表明線粒體的摻入依賴于Mφ激活狀態(tài)，主要由原始EVs而不是外泌體部分介導(dǎo)。

接下來，通過共聚焦高分辨率旋轉(zhuǎn)圓盤圖像的共定位分析，研究了用EVs處理的Mφ中外源線粒體的細胞內(nèi)情況。發(fā)現(xiàn)6.58% (±2.00)和10.14% (±2.85)的 MitoDsRed+線粒體分別與溶酶體(LAMP1)或過氧化物酶體(PMP70)標記物共定位。這些發(fā)現(xiàn)表明 MitoDsRed+線粒體向這些細胞區(qū)室的運輸有限。相反，48.24% (±4.43)和17.75% (±3.56)的線粒體被發(fā)現(xiàn)附著或包含在宿主的線粒體網(wǎng)絡(luò)中。

為了進一步解決外源線粒體融合和摻入Mφ內(nèi)源性線粒體網(wǎng)絡(luò)的可能性，我們首先使用分裂自締合熒光蛋白(FPs)來檢測EVs與Mφ線粒體的接觸。用LPS刺激瞬時表達與線粒體蛋白TOMM20融合的sfcherry 211蛋白的Mφ(即MφsfCherry2,11)，并用來自瞬時表達sfcherry 2,1-10蛋白的NSCs的EVs(即EVssfCherry2,1–10)處理。sfCherry2 FP的熒光信號與MφLPSendogenous線粒體網(wǎng)絡(luò)并列，表明EVs與宿主線粒體網(wǎng)絡(luò)融合。然后進行了相關(guān)光電子顯微鏡(CLEM)實驗，通過結(jié)合免疫熒光標記和高分辨率超微結(jié)構(gòu)來研究顆粒摻入， MitoDsRed+信號與整合在宿主MφLPS線粒體網(wǎng)絡(luò)中的超微結(jié)構(gòu)確定的線粒體完全共域。

因此，表明大多數(shù)EV相關(guān)線粒體優(yōu)先從促炎Mφ中的溶酶體和過氧化物酶體途徑逃逸，而與內(nèi)源性線粒體網(wǎng)絡(luò)共定位和融合。

結(jié)果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻具體看，或者私聊我要文獻資料，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻：

[1]Peruzzotti-Jametti, L; Bernstock, JD; Willis, CM; et al.Neural stem cells traffic functional mitochondria via extracellular vesicles.[J].PLoS Biol.2021,19(4):e3001166

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