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mfl234新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
網(wǎng)上找了一份基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮的protocol，好多問(wèn)題想問(wèn)，求交流
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第一次做，啥也不懂，實(shí)驗(yàn)室也沒(méi)有protocol，只能自己上網(wǎng)找了一份，但還是好多問(wèn)題不明了，跪求各位大神解答（T-T） 材料準(zhǔn)備：洋蔥、質(zhì)粒、金粉、MS培養(yǎng)基、無(wú)菌濾紙、無(wú)水乙醇、70%乙醇、亞精胺、離心管、可裂膜、載體膜、阻擋網(wǎng) （這里有個(gè)問(wèn)題：老師說(shuō)只提供機(jī)器，讓我們自己準(zhǔn)備金粉等耗材，我想問(wèn)一下，耗材除了金粉和可裂膜之外，還包括載體膜和阻擋網(wǎng)嗎？） 洋蔥表皮的獲得： 購(gòu)買新鮮的洋蔥，用刀片和鑷子取新鮮的內(nèi)表皮 2 cm×2 cm 內(nèi)層向下平鋪在 MS 固體培養(yǎng)基上，用于基因槍轟擊。 金粉的制備： （1）稱取 30 mg金粉放入以 1.5 ml的離心管中； （2）加入 1 ml 70 %的酒精，充分渦旋震蕩 15min，13000 rpm離心 3 min，去除上清； （3）重復(fù)步驟（2）一次； （4）加入 1 ml無(wú)菌水重懸沉淀，13000 rpm離心 3 min，去除上清； （5）重復(fù)步驟 4 二次； （6）加入 500μl無(wú)菌水重懸沉淀，-20°C 保存?zhèn)溆谩? 質(zhì)粒的包埋： （1）將 10 μl 金粉 （60 mg/ml） ，0.5 μg 質(zhì)粒、4μl 0.1M亞精胺和 8 μl 2 mol/L CaCl2 加入一個(gè)滅菌的離心管渦旋震蕩 3 min； （2）放在冰上 10 min； （3）加入 140 μ l無(wú)水乙醇，充分渦旋震蕩后，12000 rpm離心 10 s； （4）去掉上清液，加入 140 μ l 70% 乙醇，渦旋震蕩后，12000 rpm離心 10 s； （5）去掉上清液，加入 200 μ l 100% 乙醇，將管放在冰上備用。 基因槍轟擊： （1）將高壓氣體基因槍放置在一個(gè)較大型號(hào)的超凈臺(tái)上，打開(kāi)超凈臺(tái)的紫外燈，滅菌 30 min以上； （2）用浸泡消毒法將可裂膜（Rupture disk, 1100 psi） 、載體膜（Macrocarrier） 、阻擋網(wǎng)（Stoppingscreen）于無(wú)水乙醇中消毒 15 min，然后置于無(wú)菌濾紙上，在超凈臺(tái)中吹干； （3）打開(kāi)氦氣體瓶閥，調(diào)節(jié)壓力至 1300 psi （高壓表頭數(shù)值） ； （4）安裝可裂膜于其托座上，順時(shí)針拉到氣體加速器上； （5）用 20 μ l移液器將 5 μl制備好的 DNA 子彈微粒滴于載體膜正中上，吹干； （6）將空間環(huán)、阻擋網(wǎng)、阻擋網(wǎng)托座、微粒載片及固定環(huán)安裝好，旋緊蓋了，插入基因槍； （7）用鑷子將樣品皿放入基因槍樣品室的樣品架上，關(guān)好門； （8）按下真空開(kāi)關(guān)，真空泵開(kāi)始工作，當(dāng)真空度達(dá)到 26-28 英寸汞柱時(shí)，即可按 hold 按鈕，接著按發(fā)射鈕并保持至聽(tīng)見(jiàn)氣體沖破可裂膜的聲音為止； （9）關(guān)閉真空按鈕開(kāi)關(guān)，按下真空釋放按鈕，使系統(tǒng)卸荷并將樣品取出，這樣一次基因?qū)朐囼?yàn)完畢； （10） . 從阻擋板圓孔穴中取出載體膜， 接著擰下封口螺母， 從圓孔臺(tái)上取出已經(jīng)穿孔的可裂膜； （11）從步驟 4 開(kāi)始重復(fù)操作，完成所有樣品處理。 （12）關(guān)機(jī)：把氦氣瓶總開(kāi)關(guān)旋緊，打一次空槍，到氦氣表指針回零后，在逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)氦壓表調(diào)解閥，關(guān)閉基因槍的總幵關(guān)及變壓器開(kāi)關(guān)。 洋蔥培養(yǎng)及觀察： 將轟擊過(guò)的洋蔥表皮暗培養(yǎng)過(guò)夜，然后熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。 （有一個(gè)疑問(wèn)：因?yàn)橐^察的基因是定位在細(xì)胞膜上的，所以為了觀察清楚，最好讓細(xì)胞質(zhì)壁分離。那我可不可以在過(guò)夜培養(yǎng)之后，把洋蔥表皮放在載玻片上，然后用高濃度的蔗糖溶液去浸泡它呢？）@biostar2009 |
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