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abcjlm銅蟲 (小有名氣)
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[求助]
鎳柱純化 已有3人參與
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因鎳柱都是有載量的，如果用低于目的蛋白的含量載量的鎳柱體積對目的蛋白的純度有提高嗎？相對使用高于目的蛋白含量的鎳柱體積 一直好奇這個(gè)問題，然而又沒辦法實(shí)踐，我想的是雜蛋白的吸附能力應(yīng)該沒有目的蛋白強(qiáng)，就像咪唑洗脫一樣，有人跟我說因?yàn)槟闶褂玫捏w系是一樣的，一直是同樣濃度掛柱的，是不會(huì)有作用的，可我想的是流穿不是目的蛋白的含量很低嗎？后來掛不上柱子的目的蛋白濃度不是越來越高嗎？然后同事說那和用低濃度咪唑洗有什么區(qū)別，我是一直繞不過來，有什么好的解釋嗎？ |
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fuyuandj86
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2樓2021-06-23 13:38:24
原海亮
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
abcjlm(fuyuandj86代發(fā)): 金幣+3 2021-07-03 14:45:35
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
abcjlm(fuyuandj86代發(fā)): 金幣+3 2021-07-03 14:45:35
本來似乎大概明白你的問題了，然后又被你的描述繞的暈暈乎乎 你可能是想知道柱子過載和未飽和兩種方式對最終產(chǎn)品的純度的影響。 首先，這樣的對比實(shí)驗(yàn)為什么是沒有辦法實(shí)踐的呢？在我們第一次使用鎳柱的時(shí)候，根據(jù)說明書可以計(jì)算一個(gè)的理論掛載量，但實(shí)驗(yàn)中的實(shí)際掛載量還是要在第一次摸索條件時(shí)候進(jìn)行確定，即你要一直上樣直至飽和過載后，流穿液中目的蛋白開始增加，證明柱子吸附目的蛋白的量已經(jīng)基本飽和。這個(gè)摸索最大載量的過程，其實(shí)就可以作為你驗(yàn)證過載與未過載的一個(gè)對比實(shí)驗(yàn)。 其次，如樓上所述，鎳柱未飽和情況下，是會(huì)有個(gè)別雜蛋白結(jié)合，但結(jié)合量有限，因?yàn)殡s蛋白與目的蛋白結(jié)合能力的差異，在雜蛋白結(jié)合同時(shí)伴隨著你目的蛋白也在大量結(jié)合的，這樣相對來講，這個(gè)雜蛋白的增加對后續(xù)影響不大。重要的是你的洗脫條件，掛柱過程中增加的雜蛋白基本上在后續(xù)合適的洗脫條件下就被分離了，這個(gè)雜蛋白的增量，對你大量結(jié)合的目的蛋白的純度影響不大。 最后，如果從生產(chǎn)成本和產(chǎn)品收率來講，應(yīng)該充分的利用鎳柱的掛載量，而上樣量也應(yīng)接近柱掛載量為適。對產(chǎn)品純度的影響最重要的是目的蛋白的性質(zhì)及洗脫條件的摸索，不太理解你說的“可我想的是流穿不是目的蛋白的含量很低嗎？后來掛不上柱子的目的蛋白濃度不是越來越高嗎？”，如果住子未飽和，那么流穿液里目的蛋白含量是很低甚至沒有，但是掛不上柱子流穿的蛋白濃度，最多不是和柱前液濃度相當(dāng)么，你是和那個(gè)樣品對比，目的蛋白越來越高了？ |
3樓2021-06-24 09:17:12
迷霧1森林
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雜蛋白對后續(xù)影響不大的意思是用咪唑洗脫后雜蛋白的多少跟你上樣的操作和選擇柱體積關(guān)系不大是不是，純化后蛋白雜就是雜，需要使用離子柱或分子篩是不是。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2021-06-24 11:42:10
walking dead
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5樓2021-06-25 08:47:13
原海亮
木蟲 (著名寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
abcjlm(fuyuandj86代發(fā)): 金幣+3 2021-07-03 14:46:23
abcjlm(fuyuandj86代發(fā)): 金幣+3 2021-07-03 14:46:23
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上樣量及柱體積的變化對雜蛋白的量會(huì)有一些影響，但是樣品里面雜蛋白的種類不會(huì)改變，掛的雜蛋白多了，同時(shí)目的蛋白的量也相應(yīng)的多，兩者的比例不會(huì)變化太多，這樣可能會(huì)導(dǎo)致后面洗脫的時(shí)候，洗脫的次數(shù)與體積增加，對純度的影響效果被逐步的稀釋減弱。 從成本和收率角度講，我們肯定希望不浪費(fèi)物料的同時(shí)，充分利用柱子的載量，最大化的發(fā)揮其純化產(chǎn)能。 蛋白親和層析，和蛋白種類及發(fā)酵系統(tǒng)都有關(guān)系，有的蛋白一步親和即可獲得單一的目的蛋白，而有的蛋白則需要增加其他的純化工序，離子、分子篩、疏水、膜系統(tǒng)等都是可以選擇的技術(shù)手段。 |
6樓2021-06-25 10:46:20
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