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[求助]
線粒體自噬指示工具-mt-Keima質粒DMSO和自噬誘導組完全拍攝不到綠色熒光，求助！
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求助！ 問題背景是：我們實驗室從別的實驗室要了mt-Keima的質粒（mt-keima在線粒體自噬發(fā)生的時候(pH=4)，激發(fā)光在561左右nm發(fā)出來的光為紅色，在靜息狀態(tài)下(pH=4)，激發(fā)光在458nm左右呈綠色），但是我兩次瞬轉293，無論DMSO還是線粒體自噬誘導劑CCCP處理均只能拍到紅色熒光，而綠色熒光拍不到，用的是蔡司的共聚焦顯微鏡。第一次做的時候用458nm和561nm的激發(fā)光，發(fā)射光信號采集范圍由軟件本身smart setup決定，拍攝不到綠色熒光；第二次做的時候詢問了贈予我們質粒的實驗室的一個師兄，他說都用561nm的激發(fā)光，綠色和紅色信號選擇采集發(fā)射光范圍不同即可，同時他們用的是徠卡的共聚焦，需要用到between frame模式。 我的問題是：1，看了些應用mt-Keima的文獻，綠色和紅色分別用的是不同的激發(fā)光，我用同一個激發(fā)光拍出來的，紅色和綠色信號完全重疊，所以一個激發(fā)光完全行不通呀，到底應該選擇什么激發(fā)光？detection的波長采集區(qū)域需要設置為多少范圍呢？ 2. between frame 在蔡司的共聚焦上有嗎，這個功能我百度了之后我覺得對于我拍照的影響不打，覺得不相關。這個功能可能對我的實驗有影響嗎？ 3. 關于mt-keima質粒本身，是不是這個質粒就可能有問題，這個質粒按照贈予我們質粒的實驗室發(fā)表文章中引用的一篇參考文獻來看（PMID:21867919）需要提前一天用ponasteronae A處理以誘導mt-Keima的表達，但其他文獻中均沒有看到這個說法例如在PMID:28703790中。 所以求助各位大佬們，拜托幫我想想問題出在哪了，為什么我拍不出來綠色熒光信號呢？下面的兩張圖是通過手機在目鏡上拍的，但是共聚焦就拍不出來，且下面的圖片是我DMSO組，按理說不應有紅色信號。 微信圖片_20210619144423.jpg 微信圖片_20210619144429.jpg |
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Jonas彬
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