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abcjlm銅蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
發(fā)酵液過(guò)濾 已有1人參與
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| 使用BL21表達(dá)菌株，5L發(fā)酵罐發(fā)酵，離心收集菌體，使用高壓均質(zhì)機(jī)破碎，離心收集上清，但是發(fā)現(xiàn)上清液很難使用0.45um膜過(guò)濾，已經(jīng)使用10000g離心了，細(xì)胞碎片已經(jīng)被離下去了，咋怎么難過(guò)濾？是發(fā)酵液菌體死亡的原因，還是均質(zhì)過(guò)程的原因？急急急 |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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不清楚你用0.45μm過(guò)濾的目的是什么，我們通常離心收集上清后即可進(jìn)行下一步的操作。 大腸桿菌發(fā)酵菌體破碎后，上清液看似清亮（有的時(shí)候破碎液粘度大，離心分離也很難拿到清亮的上清液），里面除了一部分可溶性蛋白外，還有破壁后大腸桿菌的一些核酸等物質(zhì)，這些蛋白和核酸使得上清液不像純化水一樣，是具有一定的粘性的，所以在進(jìn)行膜過(guò)濾的時(shí)候很難過(guò)濾。 如果你的重組蛋白在上清中，又必須經(jīng)過(guò)0.45μm的膜過(guò)濾，可以嘗試在膜過(guò)濾前對(duì)上清液進(jìn)行低濃度的鹽析處理，比如用硫酸銨沉淀的方法將上清液中一些雜蛋白提前除去一部分，這樣重新離心獲得的上清會(huì)比較容易過(guò)濾（使用硫酸銨沉淀技術(shù)，應(yīng)該提前進(jìn)行小試實(shí)驗(yàn)，確定硫酸銨的使用飽和度，避免目標(biāo)重組蛋白的損失）。 祝好！ |
2樓2021-06-16 13:55:54
原海亮
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3樓2021-06-16 13:58:05
abcjlm
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4樓2021-06-16 14:14:59
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5樓2021-06-16 14:17:06
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【答案】應(yīng)助回帖
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那應(yīng)該是HIS標(biāo)簽重組蛋白純化了，其實(shí)如果你的破碎上清液肉眼觀(guān)察澄清，我們都是直接上柱了。但是親和填料昂貴，大都擔(dān)心上清液有雜質(zhì)堵塞或者污染親和填料，而過(guò)濾實(shí)施起來(lái)較困難的話(huà)，可以用普通濾紙抽濾出去不容雜質(zhì)，當(dāng)然也可以在親和層析前增加一些工藝處理的，比如我建議的鹽析，本身鹽析也屬于蛋白純化的一種工具，可以除去一些雜蛋白，為后續(xù)純化減輕負(fù)擔(dān)，這樣就可以使你的親和層析分離的效果更優(yōu)，目標(biāo)蛋白的純度更高。 |
6樓2021-06-16 16:46:00
7樓2021-07-08 15:50:58
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