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[求助]
載體測序無信號是怎么回事？ 已有1人參與
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我之前用Infusion的方法連接不上，總是連上了兩端，中間缺失。然后我就換用T4連接的方法，先連接在T載體上，然后進行菌液PCR，條帶正確，提了質(zhì)粒，雙酶切，膠回收后用于T4連接到我的骨架載體上，再進行菌液PCR，條帶正確，送菌液測序無信號，然后自己提了質(zhì)粒去測序也無信號，這是什么原因呢？ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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原海亮
木蟲 (著名寫手)
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- 專業(yè): 微生物生理與生物化學
【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
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1、樓主首先要確認挑選的克隆是正確的克隆，菌液pcr驗證正確，應該提取質(zhì)粒，并進行雙酶切驗證是否真的為陽性克隆。 2、菌液和質(zhì)粒均沒有信號，是不是載體拷貝數(shù)較低，樓主提取質(zhì)粒后有沒有進行電泳檢測，確認載體濃度高低。 3、測序沒有信號，和測序為空載還是兩個不同的問題，一方面與載體濃度有關(guān)，另一方面樓主要確認選擇的測序引物是否合適。 4、有可能測序供公司問題。 解決辦法： 1、因為不清楚樓主使用的框架載體是什么載體，是否有通用引物？ 其實樓主可以在構(gòu)建好T克隆后就進行測序（T載體本身就經(jīng)常被用來做亞克隆測序），T載體有自己的通用引物，發(fā)生沒信號的概率比較低。因為你后續(xù)是進行酶切亞克隆的，不存在PCR的過程（PCR過程可能導致錯配或突變等情況，所以一般要測序驗證），發(fā)生目標基因突變的可能性較低，即T載體克隆階段測序結(jié)果可以作為你亞克隆后的測序結(jié)果（結(jié)合雙酶切驗證結(jié)果）。 2、樓主也可以提取重組質(zhì)粒，并進行雙酶切驗證，酶切確定為正確的質(zhì)粒，且質(zhì)粒濃度OK，可將該質(zhì)粒作為樣品送測序。 同時如果確認之前選擇的引物沒有問題，那么本次可以嘗試寄送 自己的引物作為測序引物，比如你菌落PCR用的引物就可以作為測序用。 3、如果上述方法沒辦法解決，可以用你的引物對挑選的克隆進行pcr，然后膠回收你的目的條帶，將這個回收PCR產(chǎn)物和你自己的引物一同送去測序。 方法還是比困難多，祝好1 |
2樓2021-06-01 17:25:52
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感謝回復，受益良多 我已進行過雙酶切驗證，是正確的 載體濃度比較低 t載體質(zhì)粒小提濃度大概60ng T4連接以后小提濃度大概120ng 由于T載體濃度比較低，不好測序，我打算用你說的最后一種方法看看，感謝！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
3樓2021-06-01 18:10:49
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