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納米材料相關(guān)研究文獻(xiàn)分享,輕松讀完一篇文獻(xiàn)（二）: 領(lǐng)取紅包 (小木蟲手機(jī)app專屬紅包)

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今天分享一篇發(fā)表在Nature Communications（2020年IF=12.121）上的文章，名為《Immunomodulating nano-adaptors potentiate antibody-based cancer immunotherapy》[1]（免疫調(diào)節(jié)納米適配器增強(qiáng)基于抗體的癌癥免疫治療）。

目前在臨床中促進(jìn)癌癥免疫治療的策略包括兩大類，一類是利用免疫調(diào)節(jié)單克隆抗體(mAbs)使功能失調(diào)的T淋巴細(xì)胞恢復(fù)活力。阻斷細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4 (CTLA4)、程序性細(xì)胞死亡蛋白1 (PD1)和程序性細(xì)胞死亡配體1 (PDL1)的單克隆抗體是癌癥免疫治療的主要方式，近年來已經(jīng)徹底改變了癌癥治療模式。值得注意的是，大量能夠增強(qiáng)先天免疫細(xì)胞(例如自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的抗腫瘤活性的單克隆抗體也正在研究中。

另一種策略是通過嵌合抗原受體(CAR) T細(xì)胞或雙特異性T細(xì)胞接觸抗體(BiTEs)促進(jìn)效應(yīng)免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的接觸。前者是表達(dá)識(shí)別特異性腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的人工受體的工程自體T細(xì)胞，后者是雙特異性抗體(bsAbs)的高級(jí)形式，它包含能同時(shí)與T細(xì)胞受體復(fù)合物和TAA結(jié)合的雙變量片段。盡管抗癌機(jī)制不同，CAR-T細(xì)胞和BiTE有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即觸發(fā)效應(yīng)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的物理連接，促進(jìn)對(duì)后者的細(xì)胞毒性。

為了充分發(fā)揮這兩種策略的優(yōu)勢(shì)，免疫調(diào)節(jié)單克隆抗體與CAR-T細(xì)胞或BiTEs聯(lián)合使用，其效果優(yōu)于單獨(dú)使用。然而，這兩種療法在大多數(shù)情況下是獨(dú)立工作的。我們推測(cè)，將這兩種策略的特點(diǎn)整合到一個(gè)系統(tǒng)中，可能會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)免疫治療。我們提出，納米顆粒固定兩種靶向效應(yīng)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的單克隆抗體這樣的系統(tǒng)，作為免疫調(diào)節(jié)納米適配器(imNAs)，該工程制劑可能具有兩個(gè)獨(dú)特的特點(diǎn)。首先，固定化親本單克隆抗體保持了它們的免疫調(diào)節(jié)特性，其次，由于它們的多價(jià)性，它們對(duì)兩種細(xì)胞上的抗原都有很強(qiáng)的親和力，并可以像“適配器”一樣將它們連接在一起。我們預(yù)測(cè)，imNAs可以通過兩種類型的單克隆抗體的混合實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增和無法實(shí)現(xiàn)的抗腫瘤作用。至于固定到納米顆粒的方法，之前報(bào)道的方法主要依賴于化學(xué)反應(yīng)。然而，這個(gè)過程很難控制，由于mAbs和納米顆粒的高分子量，可能損傷mAbs的效價(jià)，限制臨床轉(zhuǎn)化。

本研究考慮到所有IgG抗體中的Fc區(qū)域都是相同或保守的，而且抗IgG (Fc特異性)抗體(αFc)可以通過非共價(jià)相互作用特異地識(shí)別和結(jié)合包含F(xiàn)c片段的任何單克隆抗體，通過將αFc偶聯(lián)到納米顆粒表面(αFc- NP)，我們建立了一個(gè)多功能的抗體固定化平臺(tái)(圖1a)。我們證實(shí)，αFc-NP在溫和混合形成imNAs后，可以方便有效地固定兩種單克隆抗體，而不影響親本單克隆抗體的抗原結(jié)合能力(圖1b)。我們進(jìn)一步選擇了免疫檢查點(diǎn)抑制劑αPD1(一種抗pdl1抗體)和αPDL1(一種抗pdl1抗體)作為模型單抗，表明imNAαPD1&αPDL1可以有效促進(jìn)T細(xì)胞/腫瘤細(xì)胞的相互作用，與可溶性或納米顆粒固定αPD1和αPDL1的組合相比，顯著增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。值得注意的是，在多種小鼠腫瘤模型中，在自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)中，imNAs相對(duì)于親本單克隆抗體混合物的優(yōu)勢(shì)得到了驗(yàn)證(圖1c)�？傊�，我們?yōu)閕mNAs的工程提供了一種方便、可控的方法，該方法的簡(jiǎn)單性、通用性和有效性使imNAs成為臨床轉(zhuǎn)化的一個(gè)有吸引力的候選方法。

研究過程：

一、 αFc氧化和αFc共價(jià)結(jié)合

將1 mg/mL的 αFc 在 50 mM acetate buffer (pH 4.2)（含10 mM NaIO4)中4°C溶解2h，這一步是氧化αFc上的Fc端的糖殘基；氧化αFc的恢復(fù)，使用 Amicon? Ultra Centrifugal Filters (MWCO 100 kDa, Merck Millipore)(9000×g離心5分鐘)。醛的生成由 Purpald?(4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4triazole, Sigma)檢測(cè)。將0.1mg/mL氧化的αFc與胺化NP按預(yù)定的質(zhì)量比混合，伯胺與醛基在4℃下溫和攪拌反應(yīng)12 h。最后，將硼氫化鈉(NaBH4, Energy Chemical)加入混合物中，再孵育45分鐘，以還原希夫堿中間體，并在NP和αFc之間生成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。離心收集制備的αFc- NP，上清中未結(jié)合的αFc用ELISA (goat IgG ELISA Kit, Alpha Diagnostic International)和超高效液相色譜(UPLC)檢測(cè)。αFc的結(jié)合效果(BE)計(jì)算公式如下:BE= (A-B)/A，其中A為αFc的投料量，B為上清液中的αFc。

測(cè)量粒徑分布，將NP和αFc-NP用5%葡萄糖溶液(1 mg/mL)稀釋，使用Zetasizer Nano ZS(Malvern)進(jìn)行表征。形貌檢測(cè)，將NP和αFc-NP滴鑄在硅片上，并用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(Merlin Compact)對(duì)其進(jìn)行成像。

二、 αFc-NP/單抗的構(gòu)建與表征

αPD1與αFc-NP以αPD1/αFc比1:1 (w/w)混合，4℃孵育12 h，用Zetasizer Nano ZS檢測(cè)αFc-NP αPD1的直徑。為了確認(rèn)αPD1通過FC特異性識(shí)別固定在αFc-NP上，IgG同型對(duì)照或αFc偶聯(lián)到AF750標(biāo)記的NP上，然后與AF647標(biāo)記的αPD1孵育。將混合物( (IgGNPαPD1或 αFc-NPαPD1)滴在載玻片上，沉淀10分鐘，使用 SRiS STORM Super-resolution System (NanoBioImaging)獲得圖像。

為了證實(shí)αFc-NP可以同時(shí)整合兩種單克隆抗體，將PerCP-Cy5.5偶聯(lián)的αPDL1和FITC偶聯(lián)的αPD1 (BioLegend)單獨(dú)或與αFc-NP聯(lián)合孵育12 h，然后進(jìn)行高靈敏度納米流式(HSFCM, NanoFCM)。該儀器配備了3個(gè)單光子計(jì)數(shù)雪崩光電二極管(APD)探測(cè)器，用于側(cè)向散射(SSC)和雙色熒光的同時(shí)檢測(cè)。采集數(shù)據(jù)用FlowJo v10 (Tree Star)軟件進(jìn)行分析。

αFc-NPαPD1與5%葡萄糖孵育48 h，用Zetasizer Nano ZS檢測(cè)其粒徑變化，以檢測(cè)其穩(wěn)定性。為確定 IgG來源于相同或不同宿主對(duì)αFc-NPαPD1穩(wěn)定性的影響，將αFc-NP結(jié)合PerCP-Cy5.5偶聯(lián)PDL1( αFc-NPPP-Cy5.5-αPDL1)分別與 rat IgG control 和 mouse IgG control孵育， PerCP-Cy5.5-αPDL1, rat IgG control和mouse IgG濃度均為10μg/mL。用納米流式檢測(cè)儀(HSFCM, NanoFCM)檢測(cè)孵育12 h和24 h后PerCP-Cy5.5+αFc-NPPP-Cy5.5-αPD1的比例。

三、 αPD1和αPDL1結(jié)合效率

αPD1或αPDL1與Fc-NP混合(質(zhì)量比1:1)，在預(yù)定的時(shí)間(1、2、4、8、12、24 h)4℃孵育。在20000 g×60分鐘離心，上清液中游離的αPD1和αPDL1通過ELISA檢測(cè)。

四、抗原結(jié)合能力

用100μL (5μg/mL) rmPD1或rmPDL1包被ELISA板(康寧)，在37℃條件下2 h。然后在室溫下用2% BSA（in PBST）中阻斷1小時(shí)。加入一系列濃度的自由單抗(αPD1或αPDL1)或NP固定化單抗( αFc-NPαPD1/αFc-NPαPDL1)，在室溫下孵育1小時(shí)。通過PRISM軟件(GraphPad)繪制歸一化的吸光度值與αPD1/αPDL1濃度之間的關(guān)系，得到解離常數(shù)kd。

五、體外刺激腫瘤細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞

用IFN-γ (20 ng/ml, Peprotech)刺激B16-F10或B16-F10mCherry細(xì)胞24小時(shí)。小心摘除小鼠脾臟，用無菌PBS在冰上清洗三次。脾細(xì)胞懸液經(jīng)40μm尼龍網(wǎng)過濾。使用ACK(銨-氯-鉀)溶解緩沖液(BioLegend)去除紅細(xì)胞，然后脾細(xì)胞在 magnetic-activated cell sorting (MACS) buffer中重懸，CD8+T細(xì)胞通過 CD8a (Ly2) microbeadsIsolation Kit (Miltenyi Biotec.)分離。對(duì)于T細(xì)胞刺激，分離的CD8+T細(xì)胞與板結(jié)合抗CD3抗體(5 μg/mL, BioLegend)和可溶性抗CD28抗體(5 μg/mL, BioLegend)孵育48小時(shí)。使用BD FACSCelesta?流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)評(píng)估刺激后PD1或PDL1的表達(dá)情況。

六、細(xì)胞與imNAαPD1和αPDL1的聯(lián)系

將1.0×10^5刺激后的B16-F10細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞接種到24孔板培養(yǎng)過夜，然后加入αFc-NP固定IgG對(duì)照(αFcNPIgG)或αFc-NP固定αPD1和αPDL1 (imNAαPD1和αPDL1)。用FITC標(biāo)記NPs，αPD1和αPDL1的濃度為10 μg/mL。每次時(shí)間間隔后，細(xì)胞用冰PBS洗滌三次，在BD FACSCelesta?流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)上檢測(cè)來自B16-F10細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞的FITC平均熒光強(qiáng)度(MFI)。為了區(qū)分內(nèi)化和表面結(jié)合的αFc-NPIgGor imNAαPD1和αPDL1，用臺(tái)潘藍(lán)(0.4%，Thermo Fisher Scientific)(已被證明在與FITC標(biāo)記化合物密切接觸時(shí)可以猝滅熒光)用于猝滅表面結(jié)合熒光，并在上流式之前添加到細(xì)胞懸液中。表面結(jié)合熒光(SBF)的計(jì)算公式如下:SBF=A?B，其中A和B分別表示不含或含臺(tái)盼藍(lán)猝滅的MFI。

為了直觀觀察細(xì)胞與imNAαPD1和αPDL1之間的聯(lián)系，使用 PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit (Sigma)，用紅色熒光染料標(biāo)記B16F10細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞，然后與FITC標(biāo)記的imNAαPD1和αPDL1孵育12小時(shí)，隨后使用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

七、imNAαPD1& αPDL1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞之間的相互作用

B16-F10-mCherry細(xì)胞和分離的CD8+T細(xì)胞以前文所述方法進(jìn)行刺激。將B16-F10-mCherry細(xì)胞以每皿5.0×10^3個(gè)細(xì)胞的密度接種到Nunc?玻璃底培養(yǎng)皿(Thermo Fisher Scientific)中，4小時(shí)后加入5.0 ×10^4個(gè)CFSE標(biāo)記的CD8+T細(xì)胞。共培養(yǎng)細(xì)胞分別用IgG (20 μg/mL)、FreeαPD1 & αPDL1、NPαPD1& NP αPDL1或imNAαPD1 & αPDL1處理。αPD1和αPDL1的濃度為10μg/mL。再孵育8 h后，移除懸浮的CD8+T細(xì)胞，在 Zeiss LSM880激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞的結(jié)合物。結(jié)合率，以B16-F10細(xì)胞結(jié)合一個(gè)或多個(gè)CD8+T細(xì)胞的百分比來衡量，通過 ImageJ v1.47 (美國國立衛(wèi)生研究院)在多個(gè)非重疊圖像中觀察紅/綠接觸來手工計(jì)數(shù)。

八、ELISA檢測(cè) IFN-γ, granzyme B和perforin

九、體外凋亡實(shí)驗(yàn)

檢測(cè)非抗原特異性T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，B16-F10-mCherry細(xì)胞以5.0×10^3個(gè)/孔的密度接種到 CellCarrierUltra ULA 96-well microplates (PerkinElmer)12 h。然后加入5.0×10^4刺激后的標(biāo)記了 CellTrace Blue 的CD8 + T細(xì)胞。共培養(yǎng)細(xì)胞分別用IgG (20 μg/mL)、FreeαPD1 & αPDL1、N PαPD1& N p αPDL1或imNAαPD1 & αPDL1處理。αPD1和αPDL1的濃度為10 μg/mL。將Annexin V-FITC（Thermo Fisher )加入終濃度為1μg/mL的培養(yǎng)基中檢測(cè)凋亡細(xì)胞。將培養(yǎng)皿置于37°C和5% CO2下孵育，使用 Operetta CLS? High-Content Analysis System (PerkinElmer)，48小時(shí)每隔45分鐘連續(xù)獲取共培養(yǎng)細(xì)胞圖像。使用 Harmony? high-content analysis software評(píng)估B16-F10細(xì)胞的活力參數(shù)。

檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，CD8+T細(xì)胞從OT-1轉(zhuǎn)基因小鼠分離培養(yǎng)并用anti-CD3/28抗體(5μg / mL) 刺激24 h。然后CD8+T細(xì)胞和 Hoechst 33342 標(biāo)記的B16-F10-OVA細(xì)胞以5:1或10:1的比例在100?L培養(yǎng)基（含 IgG control antibody (20 μg/mL), FreeαPD1 & αPDL1, N PαPD1 & N PαPDL1or imNAαPD1 & αPDL1）中共培養(yǎng)48h。共孵育后，上清液中和貼壁細(xì)胞的H33342用 Infinite? 200 PRO microplate plate reader進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞活力用以下公式計(jì)算：細(xì)胞生存能力= (A - B) /A，A為H33342的總量，B是上清液中的H33342。

十、體內(nèi) imNAαPD1 & αPDL1 的腫瘤積累和細(xì)胞相互作用

為研究imNAαPD1&αPDL1的腫瘤積聚，在雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)乳腺脂肪墊中注射5.0 × 10^5個(gè)4T1細(xì)胞建立原位乳腺腫瘤模型。當(dāng)腫瘤體積接近300 mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為3組，分別靜脈注射PBS、FreeαPD1 & αPDL1和imNAαPD1 & αPDL1。αPD1和αPDL1用Cy5染色(Thermo Fisher Scientific)標(biāo)記，Cy5標(biāo)記的αPD1和αPDL1注射劑量為5.0 mg / kg小鼠體重。在預(yù)定的時(shí)間間隔內(nèi)處死小鼠，利用 In-Vivo Xtreme II imaging system (Bruker)對(duì)腫瘤組織進(jìn)行熒光成像。利用 Molecular Imaging Software (Bruker)對(duì)采集的圖像進(jìn)行分析。4℃下4%多聚甲醛(Sigma)固定一夜，30%蔗糖溶液浸泡一夜，切片10 μm, DAPI染色后共聚焦顯微鏡觀察(Zeiss)。

為了驗(yàn)證imNAαPD1&αPDL1是否能增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，4T1-GFP腫瘤小鼠用FreeαPD1&αPDL1或imNAαPD1&αPDL1(5mg /kg，每3天，共3次)治療，最終注射后24 h，采集腫瘤組織，用抗CD8a抗體和Alexa Fluor?568標(biāo)記山羊抗兔IgG H&L抗體染色，然后共聚焦觀察。

十一、抗腫瘤研究

在皮下黑色素瘤模型中，將2.0×10^5個(gè)B16-F10細(xì)胞以100 μL PBS接種于6-8周齡雌性C57BL/6小鼠的右側(cè)皮下。雌性BALB/c小鼠乳腺脂肪墊注射4T1細(xì)胞5.0 ×10^5個(gè)，建立原位乳腺腫瘤模型。當(dāng)腫瘤體積約為50mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為4組(每組6只或10只)，按每3天注射一次，共注射3次，靜脈或瘤內(nèi)給藥。對(duì)于imNAαPD1&αPDL1，αPD1和αPDL1的劑量為2.5 mg/kg，而對(duì)于imNAKLRG1&αPDL1和imNAαCSF1R&αCD47，αKLRG1、αPDL1、αCSFR1和αCD47的劑量為1.5 mg/kg。用卡尺測(cè)量腫瘤垂直直徑監(jiān)測(cè)腫瘤體積，根據(jù)以下公式計(jì)算估算體積:V=L×W2×1/2 (V,體積;L,長度;W:腫瘤寬度)。每三天監(jiān)測(cè)一次體重。采用Kaplan-Meier生存分析表達(dá)生存率。

在肺轉(zhuǎn)移模型中，7.5×10^4個(gè)4T1-fLuc細(xì)胞或5.0×10^4個(gè)B16-F10細(xì)胞通過尾靜脈注入BALB/c或C57BL/6雌性小鼠，并于第二天開始治療。小鼠以200?L PBS腹腔注射D-熒光素(大連美倫)3mg，然后使用 InVivo Xtreme II imaging system (Bruker)觀察。第16天，BALB/c小鼠在D-熒光素溶液中浸泡后分離肺進(jìn)行生物發(fā)光成像。第20天，處死C57BL/6小鼠，分離肺。計(jì)數(shù)并記錄肺組織轉(zhuǎn)移灶。然后用4%多聚甲醛(Sigma)固定肺組織，石蠟包埋。切開石蠟包埋的肺，蘇木精-伊紅染色進(jìn)行免疫組化分析。

十二、流式分析

取腫瘤組織切碎，加入含有10%胎牛血清(v/v)、I型膠原酶(1 mg/mL)、透明質(zhì)酸酶(100 μg/mL)和DNase I (100 μg/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基，37°C持續(xù)攪拌25 min。消化后的細(xì)胞通過40 μm尼龍網(wǎng)，500 g離心10 min，然后裂解紅細(xì)胞(RBC)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)100ul細(xì)胞懸液(2.0 × 10^7個(gè)細(xì)胞/mL)。對(duì)于T細(xì)胞亞群的分析，細(xì)胞用以下抗體混合物染色: Alexa Fluor? 700-conjugated antibody to CD45 (Clone: 30-F11, dilution: 1:200), FITC-conjugated antibody to CD3 (Clone: 17A2, dilution: 1:400), BV650-conjugated antibody to CD8 (Clone: 53-6.7, dilution: 1:200), PE/Dazzle 594-conjugated antibody to CD4 (Clone: GK1.5, dilution: 1:200), and PE-conjugated antibody to CD25 (Clone: 3C7, dilution: 1:100). BV, brilliant violet; FITC, fluorescein isothiocyanate; PE, phycoerythrin。

胞內(nèi)因子染色，2.0×10^6個(gè)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中接種到6孔板中，并添加 eBioscience? Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors)。刺激后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記。用 Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer (BioLegend)固定和破膜。然后用 PerCP-Cy5.5-conjugated antibody to IL2 (Clone: JES6-5H4, dilution: 1:200), PE-conjugated antibody to IFN-γ (Clone: XMG1.2, dilution: 1:200) and Alexa Fluor? 647-conjugated antibody to Granzyme B (Clone: GB11, dilution: 1:200)進(jìn)行染色。所有樣本在BD LSRFortessa?流式細(xì)胞儀上采集，數(shù)據(jù)使用FlowJo v10 (Tree Star)進(jìn)行分析。

十三、數(shù)據(jù)重復(fù)性

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)兩次，結(jié)果一致。

結(jié)果展示：

結(jié)果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻(xiàn)具體看，或者私聊我要文獻(xiàn)資料，有理解得不對(duì)的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻(xiàn)：

[1]Jiang, CT; Chen, KG; Liu, A; et al.Immunomodulating nano-adaptors potentiate antibody-based cancer immunotherapy.[J].Nat Commun.2021,12(1):1359

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