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病毒相關(guān)研究文獻分享,輕松讀完一篇文獻（一）: 領(lǐng)取紅包 (小木蟲手機app專屬紅包)

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今天分享一篇發(fā)表在Angewandte Chemie（2020年IF=13.734）上的文章，名為《Quantitative Assessment of the Physical Virus Titer and Purity by Ultrasensitive Flow Virometry》[1]（用超靈敏流式病毒測定法定量測定病毒的物理效價和純度）。

自2019年12月以來，由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARSCoV-2)引起的冠狀病毒病-19 (COVID-19)已影響全球9600多萬人。雖然病毒感染仍然是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率的主要原因，但基于病毒的產(chǎn)品正在被開發(fā)用于各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。例如，基于滅活或減毒病毒的疫苗是預(yù)防傳染病的第一道防線。重組腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒等病毒被廣泛用作基因治療載體。溶瘤病毒具有特異性感染和殺死癌細(xì)胞的能力，被用作癌癥治療藥物。此外，噬菌體被用于對抗耐抗生素細(xì)菌，并在食品工業(yè)和畜牧業(yè)中作為生物防治劑。此外，病毒納米顆粒的外表面和內(nèi)表面都可以通過化學(xué)或基因修飾來設(shè)計，以顯示免疫原性，靶向特定細(xì)胞，并提供治療載荷。

病毒效價的測定一直是病毒學(xué)的基本要求，也是一項艱巨而富有挑戰(zhàn)性的工作。鑒于病毒制劑中存在大量雜質(zhì)，如細(xì)胞碎片、不完全或異常形式的病毒顆粒、牛血清白蛋白的聚集物和游離核酸等，與完全成熟的病毒粒子共存，確定病毒的真實效價是確保病毒效力的最重要的質(zhì)量控制措施之一�？瞻咴囼炇遣《径康慕�(jīng)典方法，但需要1-2周(哺乳動物病毒)或1-2天(噬菌體)來確定感染滴度。雖然酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)可以分別測定病毒的特定蛋白和核酸序列，但這些“批量”分析方法的嚴(yán)格性較低，因為它們無法區(qū)分來自完全病毒粒子或空衣殼、可溶性病毒蛋白和包裹在衣殼內(nèi)或溶液中游離的病毒核酸的蛋白質(zhì)。盡管不斷有新的、精細(xì)的病毒檢測方法被開發(fā)出來，但只有很少的方法適用于病毒產(chǎn)品的常規(guī)研究或質(zhì)量控制。

隨著儀器設(shè)備、熒光染料和標(biāo)記策略的發(fā)展，流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)已被用于單個細(xì)胞分析，并被用于單個病毒顆粒分析，最近被稱為“流式病毒分析術(shù)”。然而，由于病毒尺寸小(17-350nm，大多數(shù)接近或小于100nm)，散射強度與顆粒尺寸呈指數(shù)相關(guān)性，單個病毒的彈性散射光通常低于儀器的檢測限度，導(dǎo)致病毒濃度計數(shù)不足。盡管在商業(yè)儀器和定制儀器上對單個病毒的檢測已經(jīng)做出了很大的努力，但用光散射測量來檢測小于100 nm的病毒仍然很困難。因此，通常采用核酸染色來區(qū)分病毒和非熒光背景噪聲。盡管如此，在病毒制備中，同時檢測單顆粒散射光對于區(qū)分完整病毒粒子和其他非傳染性污染物很重要。將鞘流單分子熒光檢測技術(shù)與降低檢測區(qū)背景的方法相結(jié)合，我們構(gòu)建了一個納米流式儀(nFCM)，能夠使用光散射檢測單個二氧化硅納米顆粒和直徑分別小至24和27nm的病毒。對于nFCM，納米顆粒尺寸的分辨率與電子顯微鏡相當(dāng)，其尺寸范圍涵蓋了絕大多數(shù)病毒。與傳統(tǒng)FCM相比，nFCM的靈敏度顯著提高，其原因是基于以下綜合效應(yīng)：1)減少了探針體積(約25 fL)以降低背景；2)延長了納米粒子在激光束中的停留時間(0.3-2 ms)以增加光子產(chǎn)生；3)單光子計數(shù)雪崩光電二極管(APD)探測器，以提高光子檢測的量子效率；4)優(yōu)良的光學(xué)，限制視場的APD探測器僅對樣本流，非常好的減少背景。利用nFCM在單納米顆粒側(cè)向散射和熒光檢測方面的優(yōu)越性，我們開發(fā)了一種簡單快速的方法來定量病毒的物理效度和純度。首次采用SYTO 82核酸染色，在不固定、不加熱的情況下，有效標(biāo)記DNA、RNA、包膜和非包膜病毒等各類病毒的核酸。

使用噬菌體T7(二十面體衣殼55nm直徑的頭部，包含DNA長度為39937bp的基因組)作為模型，圖1顯示了使用實驗室建立的nFCM原理圖，同時檢測單一病毒的散射(SSC)和熒光(FL)。利用SYTO 82膜透性染料標(biāo)記病毒10 min，其信號良好，樣品外顯率優(yōu)良。DNA結(jié)合的SYTO 82的熒光激發(fā)和發(fā)射最大值分別為541 nm和560 nm。完整的病毒粒子、空衣殼和游離的病毒核酸有望表現(xiàn)出SSC和FL信號的不同特征。圖1 b顯示了純化的噬菌體T7用1uM SYTO 82染色。由于nFCM具有優(yōu)越的靈敏度，對于每個T7病毒粒子，散射光和熒光信號同時檢測，信噪比(S/N)為253/74。數(shù)據(jù)采集1分鐘后，F(xiàn)L和SSC的二維散點圖和各自的直方圖如圖1 c。100nm已知濃度的熒光聚苯乙烯微球作為外部標(biāo)準(zhǔn)來確定病毒粒子的濃度。

噬菌體T7的檢測濃度在1.8 X 10^5到1.3X 10^8 PFU mL^-1, nFCM分析與空斑計數(shù)線性相關(guān)，R^2為0.999，斜率為1.094±0.004。如表1所示，噬菌體T7的可靠計數(shù)可在濃度低至2 X 10^5 VP mL^-1，數(shù)據(jù)采集時間為1分鐘進行獲取。如果數(shù)據(jù)采集時間延長到10min或更久，應(yīng)采用濃度為2 X 10^4 VP mL^-1或更低。這種檢測限(LOD)肯定低于空斑試驗或基于qPCR的技術(shù)的1-10病毒。然而，用nFCM計數(shù)可以在不到30分鐘內(nèi)完成，并可以消除溶液中病毒核酸的干擾。因此nFCM對于病毒濃度通常高于10^6 VP mL^-1的病毒產(chǎn)品的常規(guī)質(zhì)量控制更加有效和實用。

對完整病毒和病毒樣顆粒的有效區(qū)分是有效定量病毒滴度的前提。為了檢驗用nFCM區(qū)分完整病毒粒子、空衣殼和病毒基因組的可行性，首先用1uM SYTO 82染色后分別分析這三種成分。類似于圖1 b，圖2 a表示完整T7病毒粒子的SSC信號和FL信號具有極好的靈敏度。對于T7空衣殼，只檢測到SSC信號，豐度遠(yuǎn)低于完整T7病毒粒子，這可以歸因于空衣殼的折射率比完整的病毒粒子的折射率低，因此散射較少的激光。圖2c顯示，溶液中游離的T7 DNA只顯示出FL信號，沒有同時檢測到散射光。然而，令我們驚訝的是，F(xiàn)L的峰值高度僅為完整T7病毒粒子的48%，這與核酸長度相等的情況不一致。然后我們將這三種成分混合，并用nFCM進行分析。圖2d顯示了SSC和FL信號的典型信號峰，其中T7的典型完整病毒粒子、空衣殼和病毒DNA分別用紅圈、藍星和綠色方框標(biāo)記。FL和SSC的二維散點圖表明T7衣殼和T7 DNA可以和T7完整病毒清晰區(qū)分(圖2e)。有趣的是，病毒包含的DNA分子熒光強度和T7游離DNA大約是相同的，盡管有很大程度上不同的熒光峰值高度。這一現(xiàn)象可以通過比較這兩種成分的峰高和峰寬來解釋。由于在樣品進入流動池的地方產(chǎn)生的水動力的拉伸，以擴展的構(gòu)型通過檢測探頭，導(dǎo)致較低的峰值信號但較長的脈沖持續(xù)時間。單個病毒粒子與空病毒衣殼和游離病毒DNA的明顯區(qū)別表明，nFCM在表征基于病毒的基因傳遞系統(tǒng)的誘捕效率方面具有巨大的潛力。

病毒進化出了專門的分子機制，在其感染的細(xì)胞內(nèi)有效地運輸它們的基因組，從而可以作為納米尺度的載體，將核酸運送到宿主細(xì)胞。例如，腺病毒(Ad)載體已在基因傳遞的實驗和臨床模型中得到廣泛研究。腺病毒是一種非包膜病毒，具有80-120 nm的二十面體蛋白衣殼，包含約36000 bp的dsDNA基因組。在重組Ad (rAd)的生產(chǎn)過程中，空衣殼和未完全加工的病毒蛋白總是與成熟的病毒粒子共存(圖3a)。因此，基因轉(zhuǎn)移的有效性將顯著影響在給定的病毒載體中感染顆粒的百分比。圖3b和3c顯示了一個商用rAd-EGFP載體的nFCM分析，該載體是通過將一個綠色熒光蛋白基因傳遞到神經(jīng)元上而開發(fā)的，用于神經(jīng)追蹤。為了使游離DNA引起的熒光背景最小化，將商品化的rAd-EGFP載體稀釋810倍，用DNase I (1.4 UuL^-1, 37℃ 30分鐘)，然后用1uM SYTO 82溶液和2uM SYTO 82溶液1:1混合進行染色。我們可以從FL和SSC的二維散點圖中看到，成熟的rAd-GFP病毒粒子(橙色點)在核酸染色時很容易與雜質(zhì)(綠色點)區(qū)分，和rAd-EGFP樣品的純度(定義為成熟的病毒粒子除以總事件)(圖3b) 為43.5%。值得注意的是，總粒子數(shù)可能大部分來自宿主細(xì)胞分泌的細(xì)胞外囊泡，因為它們是常見的病毒制劑污染物。

結(jié)果就展示這么多，文章還對商品化噬菌體cocktail、病毒疫苗的檢測做了分析，有興趣的話可以自己找這篇文獻具體看，或者私聊我要文獻資料，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻：

[1]Niu, Q; Ma, L; Zhu, S; et al.Quantitative Assessment of the Physical Virus Titer and Purity by Ultrasensitive Flow Virometry.[J].Angew Chem Int Ed Engl.2021,60(17):9351-9356

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