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| 【懸賞金幣】回答本帖問題，作者潘小陽陽陽將贈送您 10 個金幣 | ||
[求助]
為什么從T載切下來的目的片段連接不上目的載體？ 已有1人參與
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首先我的目的片段2.3kb左右、T載2kb左右、目的載體12kb左右，好不容易連接上了T載，然后測序正確。就開始從T載上面酶切目的片段（條帶一小點不容易分開），應(yīng)該影響不大，畢竟T載和目的載體抗性不同，之后酶切目的載體。用T4連接酶連接目的載體和目的片段，單克隆長得挺好，陽檢目的片段無條帶，死活連不上去。目的載體應(yīng)該沒有問題，因為連接另外一個0.4kb左右的目的片段已經(jīng)成功（酶切位點和2.3kb的酶切位點一樣）請教各位大神接下來要怎么辦？自己做過的改進： 1.目的片段應(yīng)該正確，因為從T載上酶切時條帶正確，已經(jīng)改變好幾次目的片段濃度，增加過0.5倍、1倍甚至兩倍 2.16度過夜酶切過12h、16h、18h， 3.之前擔(dān)心還是目的片段問題、又重新做了幾遍，結(jié)果一樣 4.酶切位點的選擇確定完全正確 這些改變的結(jié)果都是有菌落產(chǎn)生、陽檢目的片段長度沒有條帶 只有引物二聚體 孩子實在是沒辦法了，求教各位大神！ 小女子在此拜謝 發(fā)自小木蟲IOS客戶端 |
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2樓2021-05-26 14:59:16
fengxueren
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3樓2021-05-26 23:30:29
fengxueren
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4樓2021-05-26 23:31:02
原海亮
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【答案】應(yīng)助回帖
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看了樓主的問題，覺得有以下思路可以分析嘗試： 1、目的片的方面考慮，因與T載體大小接近，為了避免酶切后回收過程中摻入T載體，可以適當(dāng)提高瓊脂糖濃度（即提高凝膠條帶分離度），同時增加瓊脂糖凝膠的長度，增加跑膠時間，300bp的差異還是可以用凝膠分離開的，最后切膠回收目標(biāo)條帶。 2、目標(biāo)載體方面考慮，不清楚樓主的目標(biāo)載體是否是從空載體出發(fā)雙酶切處理的，因為空載體進行雙酶切處理，是否酶切完全是比較難以檢測的，電泳也無法判斷雙酶切均完全（常常導(dǎo)致大量假陽性）。 所以我們常用的方法是用實驗室已經(jīng)驗證OK 的其他重組載體出發(fā)進行雙酶切處理，比如，你提到的已經(jīng)成功構(gòu)建了一個12K+400bp的重組載體，并且酶切位點還一致，那么你可以直接提取該重組載體質(zhì)粒出發(fā)進行雙酶切，酶切后通過電泳上是否有400bp條帶來判斷目標(biāo)載體是否酶切完全，通過膠回收拿到酶切完全的目標(biāo)載體片段。 3、連接體系方面考慮，如果按上述1、2方法獲得了正確的片段與載體，那么還有一個問題要提醒的，就是膠回收后的目的條帶和載體，一定要進行電泳檢測，一方面確認經(jīng)過膠回收確實獲得了目的條帶（排除膠回收過程意外導(dǎo)致未拿到目的片段），另一方面可以初判片段和載體的濃度差異，為連接體系濃度比提供參考。 當(dāng)確認載體和片段回收都OK了，你提到了嘗試增加目的條帶濃度來提高連接效率，這個思路沒有問題，按經(jīng)驗甚至可以建議你盡量多的加入你的目的基因（10倍或更高），載體微量即可，因為畢竟目的基因片段過量不會對后續(xù)陽性篩選造成太大的麻煩，雖然單菌落數(shù)會比較少，但陽性率比較高。而一旦載體過量就有可能造成一些假陽性，平板長滿了菌落并不是什么好事，空載率也會很高，影響結(jié)果。 4、轉(zhuǎn)化遺傳操作系統(tǒng)考慮，不清楚樓主實驗使用宿主菌是哪個菌屬，但12K+2.3K的重組載體也屬于比較大的重組質(zhì)粒了，可能對你的轉(zhuǎn)化方式及感受態(tài)要求會高一些，也是需要考慮的因素。 5、陽性克隆篩選方面考慮，看樓主的問題描述，可能是使用的菌落PCR進行的陽性篩選。對于常做分子克隆的的技術(shù)人員來講，菌落PCR其準(zhǔn)確性可靠性低于酶切驗證和測序驗證，常作為一個初篩的技術(shù)手段，換句話講就是菌落PCR陰性不一定就代表為假陽性，畢竟PCR受影響的因素比較多，我們實驗中也常常遇到菌落PCR沒有條帶，但是提質(zhì)粒酶切驗證及測序均正確的情況，后來我們基本上不使用PCR了，直接提質(zhì)粒酶切驗證，所以樓主可以嘗試對挑選的克隆進行提質(zhì)粒雙酶切驗證，這個應(yīng)該是非常直觀準(zhǔn)確的方法。 當(dāng)然，如果非要進行菌落PCR，可適當(dāng)增加陽性對照和陰性對照，排除PCR過程中的意外因素干擾。 這是對整個分子克隆過程主要因素分析的，希望可以為你解決難題提供思路，祝好！ |
5樓2021-06-01 16:35:49
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