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今天分享一篇發(fā)表在 J Extracell Vesicles（2020年IF=14.98）上的文章，名為《Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge?》[1]（用正交法測定多模式合成標準物質和細胞外囊泡的顆粒濃度:誰能勝任這一挑戰(zhàn)?）

本研究在可重復性、準確性和可接受性方面，通過深入分析EVs分離物的關鍵質量屬性：濃度和尺寸分布，為50-300nm范圍的顆粒濃度測量進一步開發(fā)可靠的技術和分析方案。全面詳細的對比了NTA、TRPS、nFCM、CLS、AF4-MALS和MADLS這6種方法，具體如下表。

研究過程：

一、聚苯乙烯顆粒

從Thermo Scientific購得60nm (+/i- 4nm)、100nm (+/- 3nm)、152 (+/- 5nm)、203 (+/- 5nm)、240 (+/- 5nm)物理直徑的NIST可溯源聚苯乙烯顆粒。這些平均直徑是由Thermo Scientific使用透射電子顯微鏡(TEM)認證的。顆粒濃度以%(M/V)固體方式(所有上述標準為1%固體溶于水)，分別的名義濃度以“顆粒/ml”通過聚苯乙烯的平均直徑和密度為1.05 g/cm3，計算得到分別為8.4E+13/ml, 1.82E+13/ml, 5.18E+12/ml, 2.17E+12/ml和1.32E+12/ml, 分別為CPN60, CPN100, CPN150，CPN200和CPN240。

由于缺乏CPN粒子濃度的可溯源信息，NIST可溯源標準的相對標稱濃度(范圍為60-2500nm)采用TRPS進行預分析。如補充信息(SI)中所述，本研究中使用的NIST可溯源標準的完整尺寸和濃度表征受到最大關注。然后使用NTA、TRPS、MADLS、CLS、nFCM和AF4-MALS對含有CPN60、CPN100、CPN150、CPN200和CPN240聚苯乙烯珠的混合物樣品的粒徑和濃度進行評估。

二、聚苯乙烯顆�；旌衔镏苽�

用D-PBS (CaCl2和MgCl2) + 0.03% 吐溫-20對CPN60、CPN100、CPN150、CPN200、CPN240分別進行稀釋。根據平均尺寸、固體含量和密度信息計算的初始顆粒濃度，按照表2中詳細列出的體積稀釋法，將每個標準品的濃度降低到10^10/ml，用于生產后續(xù)混合物。

使用一套稀釋至10^10/ml濃度的標準品，由一個獨立方配制了10種不同成分的混合物。這些混合物，以及單峰標準本身，使用不同的技術進行分析，每個操作者進行盲測以防止偏差。

三、脂質體

本研究中使用的聚乙二醇脂質體配方相當于Doxil(脂質體阿霉素，R)的非藥物對照。脂質體配方由三種不同的脂質組成：膽固醇、HSPC和MPEG-DSPE，重量比為20.7 : 57.9 : 21.9，總脂質含量為15.6 mg/ml。脂質體購自lipoure。根據分析，本研究中使用的批次(批次#500010)的平均水動力直徑為78 nm。

四、細胞外囊泡(EV)樣品制備

使用凝血常規(guī)凍干血漿(diagnostics Stago)進行EV分離，也被定義為“小顆粒分離”。血漿樣品按照說明書制作。重組后，將10?l凝血酶加入1 ml重組血漿中。將含凝血酶的血漿輕輕混合15 min, 3000×g離心15 min，將上清轉移到新的微量管中。重復離心樣品上清。隨后使用MILLEXGP 0.22?m濾膜對樣品進行過濾。

使用IZON qEV original/70nm size色譜柱，根據說明書進行EV分離。IZON提供的這些柱子包含孔隙大小約70nm的樹脂，最適分離粒徑范圍為70 - 1000nm, 室溫下大約1.0ml/min的流速，最大加載量0.5ml，柱子體積10ml，孔隙體積大約3ml。柱子由PBS預填充，包含0.05%的疊氮化鈉。qEV柱分離EV的時間通常小于15分鐘，得到高度純化的囊泡。在尺寸排阻過程中，蛋白質和其他小于70 nm的污染分子進入樹脂的孔，并延遲通過柱，主要是在包含EV的體積之外的洗脫。大部份的EVs在3ml的空隙體積之后的1.5ml中洗脫。隨后采集500?l樣本，并提供等分樣本用于幾種不同方法檢測。

五、納米粒子跟蹤分析（NTA）

用D-PBS (CaCl2和MgCl2) + 0.03% tween-20配制NTA的樣品稀釋液，工作體積為1ml，以獲得NTA的最佳顆粒濃度(每個視場10到50個顆粒)。樣品在加載前進行短暫的渦旋，以確保充分的混合和均勻性。將樣品(約600?l)裝入NanoSight儀器。所有樣品(聚苯乙烯、脂質體和EV分離物)均進行3個重復測定。

在將nFCM添加到用于本研究比較的技術中，使用NTA和TRPS對聚苯乙烯單模態(tài)和多模態(tài)樣品進行了再次評估，并將結果與原始測量結果進行了比較。NTA儀器設置保持不變，以使測量結果具有可比性。這樣做是為了確認聚苯乙烯基樣品從原始測量到nFCM測量完成期間的穩(wěn)定性和完整性。

六、可調諧電阻脈沖傳感（TPRS）

TRPS屬于電阻脈沖傳感分析技術，其中膠體粒子懸浮在導電溶液中，通過膜上的一個或多個孔，產生電阻脈沖。這些電脈沖可以通過IZON Science Control Suite v. 3.3進行收集和分析，作為qNano的接口，并執(zhí)行所需的校準，將測量到的孔隙堵塞的數量和大小分別轉換為顆粒濃度和直徑。

將含有表面活性劑(0.03%吐溫-20)的PBS液分別放置在含有一個電極的液體槽內，分別放置在qNano上的納米孔下面(75?L)和上面(35?L)。其模擬數字轉換器在1 MHz下工作，通過電子濾波降低到50 kHz的采樣頻率。該系統(tǒng)配備了一個基于空氣的壓力模塊，以應用所需的壓力范圍。在TPU膜中配置了可調納米孔。所有樣品進行3次重復。

七、納米流式（NanoFCM）

納米流式技術采用專業(yè)設備將標準流式細胞術的基本原理應用于亞微米顆粒。NanoAnalyzer (nanoFCM)進行了優(yōu)化，以便利用散射光(SSC)測量生物粒子如EVs和病毒等，能夠檢測到低至40nmd的顆粒。另外還有兩個熒光通道可以進一步表征粒子。

NanoAnalyzer N30儀器配備了單個488nm激光器和單光子計數雪崩光電二極管探測器(SPCM APDs)，用于檢測單個粒子的SSC(帶通濾光片：FF01?524/24)。HPLC級水通過重力進給作為鞘液，使樣品液直徑減小到約1.4?m。數據是通過NanoFCM Professional Suite v1.8軟件生成的，通過使用空白來扣除背景。

測量時間1分鐘，采樣壓力為1.0 kPa，由氣壓模塊調節(jié)并保持。樣品按要求用PBS稀釋，在1分鐘內記錄2000-12000個粒子。

在數據采集過程中，樣品流在聚焦激光束的中心區(qū)域內被完全照亮，產生了大約100%的檢測效率，從而通過單粒子計數實現精確的粒子濃度測量。

樣品的濃度通過與已知顆粒濃度的250 nm二氧化硅顆粒的比較來確定。粒徑校準則是使用專用的四種二氧化硅納米球cocktail，包含直徑為68nm、91nm、113nm和155nm的納米球。用冪函數f = c*d^n擬合四種不同二氧化硅顆粒的側向散射強度與顆粒直徑的關系，得到標準曲線。對于EV和脂質體的測量，硅混合物的最佳匹配度n約為5.3。生成的標準曲線用于脂質體和EV大小測量。需注意，瑞利散射通常適用于粒子直徑d小于入射光的波長的1/10——在我們的例子中激光波長488nm，瑞利理論適用于d<50 nm，此時散射強度尺度為d^6。

二氧化硅提供了穩(wěn)定的單分散標準，折射率約為1.43-1.46，接近文獻報道的EV 的折射率范圍(n=1.37-1.42)。使用這種校準標準可以實現精確的尺寸測量，這在nFCM與低溫透射電鏡結果比較時得到證實。脂質體的折射率也被假定為類似于二氧化硅，由于其脂質和生物組成的變化，在數據解釋過程中仍然是重要的考慮因素。

由于聚苯乙烯的折射率與二氧化硅非常不同，聚苯乙烯樣品的尺寸是通過與CPN和NIST粒子的多模態(tài)cocktail進行比較。將混合樣品中粒子的側向散射強度與CPN60, CPN100, CPN150的三峰混合物進行了比較。

八、離心液體沉降（CLS）

離心液體沉降，使用CPS盤式離心機(型號DC24000 UHR)在液體密度梯度介質中通過離心沉降分離不同大小顆粒。及時測量時，沉降過程會導致探測器前粒子濃度的變化。沉降時間與沉降速度相對應，對于分離的顆粒，沉降速度取決于它們各自的大小、形狀和密度。該儀器應用斯托克斯定律來計算在給定密度下對應于一定沉降時間的大小。利用Mie理論，利用材料在光源波長(405nm)處的折射率和吸收值，計算了測量光消光后的粒子質量濃度。根據圓盤的幾何特征和探測器的位置，利用儀器軟件生成質量加權尺寸分布曲線。

分離的密度梯度為9步，轉速為22000rpm，濃度梯度為1.6 ml的0%-8%蔗糖溶液。聚苯乙烯和EV的折射率分別為1.62和1.42，密度分別為1.05和1.07g/ml。聚苯乙烯和EV分離物的吸附值均設為0.001。為了防止蔗糖梯度水分蒸發(fā)，在最后一層上加了0.5 ml梯度蓋液（ dodecane）。CPS尺寸校準標準，即在每次測量前注射一種單分散球形聚氯乙烯(PVC)顆粒的水懸液，直徑為237nm，以確定梯度的實際性質(密度、粘度)。

九、使用多角度光散射檢測器在線進行非對稱流場流分離(AF4-MALS)

本研究中使用的AF4系統(tǒng)包括Eclipse Dualtec分離系統(tǒng)(Wyatt Technology Corp)和安捷倫1260 Infinity高性能液相色譜儀，配有除氣器(G1322A)、等度泵(G1310B)、自動進樣器(G1329B)和多波長檢測器(G1365C)，全部來自安捷倫(Agilent Technologies)。一個DAWN 8+ HELEOS II多角度激光光散射(MALS)探測器與658nm激光( Wyatt Technology)耦合到分離系統(tǒng)。90?探測器角度用于監(jiān)測信號分析。再生纖維素(10kDa)膜用于Eclipse SC分離通道(153 mm長)。間隔層高度為350?m。通道的溫度保持在25?C。

十、多角度動態(tài)光散射（MADLS）

MADLS使用Zetasizer Ultra (Malvern Panalytical)進行。樣品體積約為1ml，裝入DTS0012比色皿。每個樣品的尺寸分布，模式粒徑和顆粒濃度使用探測器在三個不同的角度測量，以考慮前(13?)，邊(90?)和后(NIBS 173?)散射光。每個樣本在每個角度測量三次，并應用 adaptive correlation，以提高總體數據質量。數據處理使用ZS Xplorer Software Suite V 1.1.0.656。

結果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻具體看，或者私聊我要文獻資料，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻：

[1]Vogel, R; Savage, J; Muzard, J; et al.Measuring particle concentration of multimodal synthetic reference materials and extracellular vesicles with orthogonal techniques: Who is up to the challenge?[J].J Extracell Vesicles.2021,10(3):e12052

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