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今天分享一篇發(fā)表在Journal of Nanobiotechnology（2020年IF=6.518）上的文章，名為《Micro/nano-textured hierarchical titanium topography promotes exosome biogenesis and secretion to improve osseointegration》[1]（微/納米結(jié)構(gòu)的分級(jí)鈦形貌促進(jìn)外泌體的生物發(fā)生和分泌，以改善骨整合）。

骨質(zhì)疏松患者種植牙的失敗率超過10%，原因是牙槽骨密度下降，牙缺失后再生能力較差，抑制骨質(zhì)疏松患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的增殖和成骨分化能力。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的分泌產(chǎn)物在骨與鈦種植體之間的骨整合發(fā)揮著重要作用。鈦種植體的表面設(shè)計(jì)已被重視以優(yōu)化良好的鈦形貌對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物反應(yīng)。然而，關(guān)于鈦形貌在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌產(chǎn)物調(diào)控中的作用知之甚少。

外泌體是由各種類型的細(xì)胞合成和分泌的，如細(xì)胞外囊泡(EVs)，它將核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他活性分子傳遞到鄰近的細(xì)胞中，進(jìn)行細(xì)胞間的通信。鈦種植體、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和外泌體之間的相互作用在骨整合過程中至關(guān)重要。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體通過激活PI3k/Akt通路，增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附、增殖和成骨分化，并促進(jìn)骨再生。小GTPase Rab27和鞘磷脂磷酸二酯酶3(SMPD3)通路控制外泌體的合成和分泌。分別通過shRNA和GW4869檢測，Rab27敲除和smpd3抑制細(xì)胞的外泌體釋放明顯減少。近年來，外泌體集成的鈦盤通過增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的黏附、增殖和成骨分化，具有良好的靶向成骨生物功能。已有報(bào)道稱，鈦表面的理化特性會(huì)影響干細(xì)胞的生物學(xué)行為和功能。然而，鈦形貌如何影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌外泌體尚不清楚。

最近，隨著最新增材制造技術(shù)-選擇性激光熔化技術(shù)(SLM)的快速發(fā)展，復(fù)雜無牙槽嵴的定制鈦種植體已經(jīng)成為可能，允許精確控制種植體設(shè)計(jì)。此外，由于SLM種植體的表面粗糙度過大，骨和SLM種植體之間的界面行為優(yōu)于轉(zhuǎn)向種植體，但低于商業(yè)種植體。通過構(gòu)建與骨組織微觀結(jié)構(gòu)相似的仿生形貌，對轉(zhuǎn)向的或原生SLM鈦合金形貌進(jìn)行表面修飾以改善BMSCs在種植體上的性能已得到廣泛研究。分級(jí)多孔結(jié)構(gòu)作為基因傳遞的納米載體和組織再生的框架已被廣泛研究。據(jù)報(bào)道，在體外和體內(nèi)，微/納米紋理的分級(jí)鈦結(jié)構(gòu)比光滑的、原生SLM或微紋理的鈦結(jié)構(gòu)更具有生物活性和仿生性，可以增強(qiáng)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化和骨-種植體骨融合。微/納米紋理的分級(jí)鈦的表面修飾通常通過陽極氧化、堿熱處理或噴砂或酸蝕刻在微紋理鈦基上的電化學(xué)沉積進(jìn)行。體外研究表明，結(jié)合酸蝕刻和陽極氧化技術(shù)或結(jié)合酸蝕刻和堿熱處理技術(shù)的微/納米紋理形貌顯著增強(qiáng)了BMSCs在鈦表面的行為。這些研究只關(guān)注在設(shè)計(jì)的形貌下BMSCs的增殖和成骨分化結(jié)果。微/納米結(jié)構(gòu)的表面形貌與細(xì)胞相互作用增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物活性和骨整合的確切機(jī)制尚不清楚�？紤]到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在骨整合中的重要性，微/納米結(jié)構(gòu)的形貌可能會(huì)影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞-鈦活性和鈦表面的細(xì)胞間通信。

本研究我們確定了來自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體的分泌行為是否受到不同鈦形態(tài)的影響。此外，我們試圖探索鈦形貌在體內(nèi)和體外對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體分泌的影響和機(jī)制。

研究過程：

一、形貌表征

采用場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM)測定各組的表面形貌。SLM樣本顯示粗糙和波動(dòng)曲面并且有一些未消融的鈦球體(直徑28.29±0.64μm)。SLA樣本顯示均勻分布的微米大小的坑(直徑平均5.62±0.65μm)，在噴砂和酸浸后沒有SLM樣品的殘余粒子。SLM和SLA樣品表面均未發(fā)現(xiàn)納米紋理的鈦形貌。在低倍率下，SAH和SAO樣品顯示了相同的直徑超過1μm的淺坑表面，類似于SLA表面上微米大小的坑。在高倍率下，SAH樣品外有301.52±51.22 nm的大孔，內(nèi)有76.27±15.57 nm的小孔(圖1h)。在SAO樣品上形成了均勻排列的納米管(平均直徑55.36±6.16 nm)。

二、鑒定 hBMSCs

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。hBMSCs間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物(CD73、CD90、CD105和CD29)的陽性率超過99%，造血表面抗原(CD45、CD19、CD34、HLA-DR和CD11b)為陰性。與非誘導(dǎo)組相比，hBMSCs的成骨、成脂和軟骨分化潛能被測定。成骨分化培養(yǎng)11天后，茜素紅染色顯示細(xì)胞外鈣沉積。成脂分化培養(yǎng)11天后，油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)包涵體形成。在軟骨分化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)21天后，經(jīng)藏紅O染色，細(xì)胞團(tuán)塊切片顯示蛋白多糖沉積和軟骨陷窩形成。

三、細(xì)胞活性檢測

掃描電鏡觀察細(xì)胞粘附和形態(tài)。SLM和SLA樣品上的細(xì)胞是多角形的，帶有短片狀足。SAH和SAO樣品中均發(fā)現(xiàn)帶有指狀絲狀足凸的細(xì)長胞體，微小的突起從這些細(xì)胞延伸到微/納米結(jié)構(gòu)的分層鈦結(jié)構(gòu)。用CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況，第一天，SAO組與SLA組之間、SAH組與SLM組之間均沒有顯著差異(p > 0.05)。SAO組在第3、5、7天對hBMSCs增殖的促進(jìn)作用最強(qiáng)(p < 0.05)，其次是SLA組和SAH組。

四、hBMSCs來源外泌體的表征

hBMSCs來源的外泌體顯示單層膜囊泡，具有圓形葡萄狀結(jié)構(gòu)。通過納米流式儀檢測，樣品粒徑分布為30 ~ 150 nm(中位數(shù)±SD, 73.0±18.7 nm)。納米流式儀檢測樣本CD63(56.8%)和CD81(50.8%)均為陽性表達(dá)。此外，western blotting分析顯示，hBMSCs來源的外泌體顯示外泌體標(biāo)記(CD63和TSG101)陽性表達(dá)，Calnexin陰性。

五、乙酰膽堿酯酶活性檢測評估鈦形貌對外泌體分泌的影響

通過分離的外泌體的AChE活性定量測定上清中釋放的外泌體。乙酰膽堿酯酶活性在SAH和SAO組中顯著高于SLM和SLA組(p < 0.05)。此外，SLA組分泌的外泌體明顯多于SLM組(p < 0.05)。

六、胞內(nèi)CD63在不同鈦表面的分布

免疫熒光染色結(jié)果顯示四組細(xì)胞核相似，細(xì)胞活力評價(jià)細(xì)胞粘附和形態(tài)結(jié)果相似。SLA樣品上的細(xì)胞比SLM樣品有更多的擴(kuò)散區(qū)域和細(xì)胞內(nèi)CD63的分布。SAH組和SAO組的細(xì)胞與相鄰細(xì)胞相連的細(xì)長胞體組的細(xì)胞內(nèi)CD63分布比SLM組和SLA組的細(xì)胞多。

七、鈦形貌對外泌體分泌相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平的影響

先前的研究表明Rab27家族和SMPD3信號(hào)通過一系列步驟控制外泌體的分泌。培養(yǎng)48h后，采用qRT-PCR檢測相對mRNA表達(dá)量。與其他3組相比，微/納米結(jié)構(gòu)的分級(jí)鈦形貌顯著提高了RAB27A、RAB27B和SMPD3的mRNA水平(p < 0.05)，但SAO組和SLA組之間的mRNA水平無顯著差異(p > 0.05)。培養(yǎng)48 h后，通過WB測定相對蛋白表達(dá)水平。與其他三組相比，微/納米結(jié)構(gòu)的層次鈦形貌顯著增加了RAB27B和SMPD3的蛋白豐度(p < 0.05)。但SYTL4的表達(dá)(Rab27效應(yīng))在SAH、SAO和SLA組之間無顯著差異(p > 0.05)。SLM組SMPD3蛋白表達(dá)顯著高于微納米結(jié)構(gòu)的分級(jí)鈦形貌組(p < 0.05)。

八、鈦形貌對體內(nèi)外泌體分泌和骨整合的影響

種植體放置后第7天，種植體部位的H&E染色顯示清晰的線，成骨細(xì)胞冠尖對齊。四組均未見骨-種植體界面炎癥細(xì)胞浸潤。采用CD63免疫組化方法檢測骨-植入界面的外泌體水平。CD63在SAH和SAO組的表達(dá)水平顯著高于SLM和SLA組(p < 0.05)。觀察和定量骨膜蛋白 Periostin(間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物)陽性細(xì)胞。骨膜蛋白在SAH和SAO組的表達(dá)水平顯著高于SLM和SLA組(p < 0.05)，這與外泌體的表達(dá)水平一致。四組間CD11b(組織巨噬細(xì)胞標(biāo)記物)的表達(dá)水平無顯著差異(p > 0.05)，但CD11b陽性細(xì)胞聚集在骨-種植體界面附近。種植體放置后28天，組織學(xué)分析顯示，SAH和SAO組的BIC比值顯著高于SLM和SLA組(p < 0.05)。

結(jié)果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻(xiàn)具體看，或者私聊我要文獻(xiàn)資料，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻(xiàn)：

[1]Zhang, Z; Xu, R; Yang, Y; et al.Micro/nano-textured hierarchical titanium topography promotes exosome biogenesis and secretion to improve osseointegration.[J].J Nanobiotechnology.2021,19(1):78

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