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今天分享一篇發(fā)表在Journal of Translational Medicine（2020年IF=4.124）上的文章，名為《Extracellular vesicles isolated by size-exclusion chromatography present suitability for RNomics analysis in plasma》[1]（ 通過尺寸排阻色譜分離的細(xì)胞外囊泡適用于血漿中的RNA組學(xué)分析）。

近年來，越來越多的研究報道，豐富的循環(huán)RNA可作為預(yù)后的標(biāo)志。例如，血清需高溫蛋白A2 (HtrA2)被報道與乳腺癌的進(jìn)展有關(guān)，特別是與CA15-3和CEA聯(lián)合可提高診斷效率。此外，血清HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA (HOTAIR)和miR-146的表達(dá)對慢性髓系白血病的伊馬替尼治療具有診斷價值或可作為靈敏的標(biāo)記物。然而，血清中存在的RNA是不穩(wěn)定的，這限制了RNA的臨床應(yīng)用。在這種情況下，細(xì)胞外囊泡(EVs)中的RNA和RNA組學(xué)為疾病診斷提供了一個潛在的生物標(biāo)志物，因?yàn)镋Vs可以保護(hù)RNA免于降解。細(xì)胞外囊泡(EVs)的直徑范圍為40 ~ 1000 nm，是由蛋白質(zhì)標(biāo)記物(如：TSG101、ALIX、CD63等)和多種生物分子，如蛋白質(zhì)、核酸、聚糖，以及其他信號分子。EVs可在幾乎所有體液中觀察到，并可被大多數(shù)細(xì)胞釋放，發(fā)揮各種功能。EVs在特定細(xì)胞間運(yùn)輸生物分子的能力賦予其作為靶向藥物遞送載體和診斷標(biāo)記物的應(yīng)用潛力。

由于許多研究報道EVs可能與疾病進(jìn)展密切相關(guān)，并提出其作為各種疾病的新型生物標(biāo)志物的作用，應(yīng)盡快開發(fā)EVs純化的最佳策略。雖然有幾種方法可以純化EVs，包括超離心、過濾、沉淀、層析、免疫親和捕獲，以及應(yīng)用上述技術(shù)的商品化試劑盒。然而，很少有證據(jù)表明，通過上述方法分離的EVs能夠提供下游功能研究。目前，所有的技術(shù)都提供了不同等級的EVs的回收率和純度。一般來說，無法從EVs中分離出的雜質(zhì)具有與其相似的尺寸或密度，因此不能以單一方式分離。這些技術(shù)的組合可以提高分離EVs的純度，但代價是明顯降低回收率。隨著醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的發(fā)展，生物樣品的多樣性和下游分析的復(fù)雜性也對EVs的純化提出了更高的要求。

根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫(https://www.exocarta.org)，多達(dá)3000個mRNAs和2800個miRNAs已在EVs中被鑒定。此外，越來越多的證據(jù)表明，lncRNAs可以通過EVs進(jìn)行分類，并影響腫瘤發(fā)生、腦功能障礙等疾病。RNA測序是液體活檢中最廣泛使用的基于EVs的生物標(biāo)志物開發(fā)技術(shù)，大量體液源EVs中的RNA已被報道為潛在的診斷標(biāo)志物。一般情況下，不同EVs分離方法獲得的RNA在效率、RNA分布特征、覆蓋程度等方面可能存在差異，導(dǎo)致分析結(jié)果的重復(fù)性較差。因此，在確定研究方案之前，需要綜合比較現(xiàn)有的EVs中RNA測序提取方法的性能。

本研究中比較了4種最終用于RNA組學(xué)分析的EVs分離方法的性能，包括UC、SEC、ExoQuick和exoEasy kit。據(jù)我們所知，本研究首次全面比較了目前最常用的四種EVs分離方法的RNA組學(xué)性能。本研究可能為理解EVs分離方法提供更多的見解，并為進(jìn)一步研究基于EVs的組學(xué)分析奠定基礎(chǔ)。

研究過程：

一、準(zhǔn)備血漿

采集同一供體4 mL新鮮血漿(采集后30 min內(nèi)完成預(yù)處理，立即進(jìn)行EVs分離，不需冷凍)，平均分成4等份，每等份采用一種特定的提取方法。來自同一供體的樣品，在一致的預(yù)處理?xiàng)l件下，將使實(shí)驗(yàn)過程中的個體因素影響最小化。EVs的分離是在沒有冷凍的情況下進(jìn)行的，以便將冷凍對樣品質(zhì)量的影響降到最低。全血標(biāo)本在室溫下暫時保存于EDTA采集管中(不超過30分鐘)。在處理前，必須確保沒有觀察到可見溶血。室溫下1600 g離心15分鐘，使細(xì)胞沉降。將上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中，10000g離心30分鐘，在室溫下清除碎片和大囊泡。使用前應(yīng)準(zhǔn)備好血漿樣品。

二、EVs分離

本研究比較了4種EVs分離方法：超離心(UC)、exoEasy kit (QIAGEN)、排阻層析(qEV [Izon]、Exosupur [echobiotech])、ExoQuick kit (Thermo Fisher)。

UC分離EVs：血漿樣品2000 g離心10 min，上清用0.22?m(Corning)過濾系統(tǒng)過濾。然后100000 g 4°C離心2 h(SW 55 Ti轉(zhuǎn)子，Beckman Coulter)，然后用PBS洗，100000 g 4°C離心2 h。沉淀用1×PBS重懸。
exoEasy分離EVs：預(yù)過濾血漿在4°C下3000g離心15分鐘。在1體積的樣品中加入1份XBP緩沖液。將試管輕輕翻轉(zhuǎn)5次，混勻溶液，并將混合物置于室溫。將混合物加到exoEasy柱，500 g離心1分鐘。丟棄流出的溶液，將柱子置于同一收集管中，加入3.5 mL XWP緩沖液，5000 g離心5 min，去除柱中的殘余液體。棄去所有流出的液體。將柱子移至新的收集管，吸附在柱上的EVs可以用XE緩沖液洗脫，用于BCA、NTA和TEM分析，或用QIAzol試劑進(jìn)行RNA分離。
SEC分離EVs：SEC按說明書(QEV (Izon)，Exosupur (echobiotech))進(jìn)行。簡單地說，先將血漿樣品2000 g離心10 min，離心后用0.22?m過濾系統(tǒng)過濾上清。然后，將血漿添加到柱的頂部。用1×PBS收集含有EVs的部分。收集的組分用100 K Amicon Ultra-15離心過濾裝置(EMD Millipore)超濾濃縮。
ExoQuick分離EVs：將血漿樣品3000g離心15 min，上清轉(zhuǎn)移至無菌管中。加入ExoQuick試劑，將離心管倒置數(shù)次，充分混合溶液。4℃靜置，1500g離心30 min，吸出上清，1500 g離心5 min，吸上清。加入1×PBS重懸沉淀。
三、納米流式檢測（NanoFCM）

在測試前分別用濃度標(biāo)準(zhǔn)品和粒徑標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行參數(shù)校準(zhǔn)。采用納米流式檢測儀收集1分鐘。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品測定樣品的顆粒濃度和顆粒直徑。

四、透射電鏡（TEM）

新鮮分離的EVs懸液用4%多聚甲醛固定1h。從不同樣品分離的EVs懸液(各約5μL)加到銅網(wǎng)形式涂層碳穩(wěn)定網(wǎng)，讓銅網(wǎng)吸收4 - 5分鐘，然后用濾紙擦除。EVs負(fù)染時，1%醋酸鈾酰水溶液(5 μL)置于銅網(wǎng)上30 s，然后用Whatman濾紙擦除。徹底干再進(jìn)行觀察。

五、Western blot分析

在提取的EVs樣品中加入200 μL帶有蛋白酶抑制劑的冰凍NP-40緩沖液，懸浮于合適的緩沖液中，制備蛋白樣品。每10分鐘混合搖勻一次，然后在冰中孵育50分鐘。蛋白質(zhì)濃度通過BCA (Applygen)檢測。然后加入2 ×上樣緩沖液(200 μL)，攪拌均勻，加熱至沸騰。蛋白質(zhì)樣品(50 μg)用8-10% SDS凝膠分離，在PVDF膜上進(jìn)行免疫印跡。然后用BSA阻斷1 h，一抗(APOB、AGO2、HSA、Alix、Tsg101、CD9或CD63)在4℃孵育過夜。然后用含0.1% Tween的Tris緩沖鹽水洗滌膜，與二抗室溫孵育1 h。然后，再次清洗薄膜，并暴露于ECL(電化學(xué)發(fā)光)。

六、ExoRNA分離和RNA分析

使用miRNeasy Mini試劑盒(Qiagen)根據(jù)說明書操作。在1.5%瓊脂糖凝膠上監(jiān)測RNA降解和污染，特別是DNA污染。使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)和安捷倫生物分析儀2100系統(tǒng)的RNA Nano 6000 Assay Kit(Agilent Technologies)評估RNA濃度和純度。所有RNA測序均使用單一樣本進(jìn)行。

七、文庫制備和測序

用Ovation?SoLo RNA- seq Library Preparation Kit (NuGEN)將每個樣本共5ng RNA作為測序庫的input，并將 index codes添加到每個樣本的屬性序列中。對于小RNA庫，每個樣本取2.5 ng RNA作為RNA樣品制備的input。使用NEB Next Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (NEB)生成測序庫，并將index codes添加到每個樣本的屬性序列中。最后，利用AMPure XP系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，并用Agilent Bioanalyzer 2100和qPCR對文庫質(zhì)量進(jìn)行評價。在acBot聚類生成系統(tǒng)上使用TruSeq PE Cluster Kitv3-cBot-HS (Illumia)，對樣本進(jìn)行聚類。聚類生成后，利用Illumina Hiseq平臺對文庫準(zhǔn)備進(jìn)行測序，生成雙端reads。

八、數(shù)據(jù)分析

變量平均值的比較采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)以mean ± SEM表示。GraphPad Prism用于統(tǒng)計(jì)分析和圖形生成(GraphPad Software)。在使用Shapiro-Wilk和Levene檢驗(yàn)正態(tài)性和相同的方差后，使用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)分析異常平均值之間的差異。P值< 0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果展示：

附圖。

結(jié)果就展示這么多，有興趣的話可以自己找這篇文獻(xiàn)具體看，或者私聊我要文獻(xiàn)資料，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻(xiàn)：

[1]Yang, Y; Wang, Y; Wei, S; et al.Extracellular vesicles isolated by size-exclusion chromatography present suitability for RNomics analysis in plasma.[J].J Transl Med.2021,19(1):104

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