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外泌體相關(guān)研究文獻分享,輕松讀完一篇文獻（三）: 領(lǐng)取紅包 (小木蟲手機app專屬紅包)

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今天分享一篇發(fā)表在 J Extracell Vesicles（2020年IF=14.98）上的文章，名為《Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms》[1]（四種正交單粒子分析平臺對細胞外囊泡和合成納米粒子的表征）。

根據(jù)細胞外囊泡(EVs)的大小、生物發(fā)生途徑、分離程序、細胞或組織來源和功能等，其亞型的分類已被提出。然而，EV亞型的可重復(fù)分類需要單粒子表征技術(shù)，包括通過表面分子或分子特征進行表型分析。從這個意義上說，目前對EV亞型的認識可以與20世紀70年代和80年代早期對免疫細胞的認識相比較。大約在那個時候，多路流式細胞術(shù)和細胞分選能力被開發(fā)出來，允許更精確的鑒定、表征以及免疫細胞亞群的分子和功能圖譜。對于更小的生物實體來說，需要使用單粒子技術(shù)將異質(zhì)EV群體劃分為定義明確、易于識別的亞群體。

在這項研究中，我們評估了幾種粒子類型和單粒子表征平臺。我們選擇生物和合成粒子。采用多種方法從H9 T淋巴細胞和U937促單核細胞培養(yǎng)液中分離EVs。之所以選擇這兩種細胞系，是因為它們表達不同水平的CD63和CD81。H9細胞CD81水平高，CD63水平低，U937細胞相反。研究人員還測試了不同尺寸的合成二氧化硅混合物和可溯源的聚苯乙烯微珠，這并不是因為它們可以模擬EVs或作為EVs的參考材料，而是因為它們已知的尺寸和成分，創(chuàng)造了一個“最佳情況”來評估測量顆粒的能力。技術(shù)平臺為：單粒子干涉反射成像傳感(SPIRIS, NanoView) （帶熒光功能）、納米顆粒跟蹤分析(NTA, ParticleMetrix) （帶熒光功能）、微流控電阻脈沖傳感(MRPS, Spectradyne) (沒有熒光功能)和納米流式檢測儀(NFCM, NanoFCM) （帶熒光功能）。

實驗過程：

材料和平臺請參見表1，品牌商、部件號和試劑的稀釋比例。這些選擇不代表任何組織機構(gòu)的推薦，不一定是最優(yōu)選擇。

一、制備粒子

人細胞系H9 (T淋巴細胞)和U937(單核細胞前)從ATCC購買。細胞用RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加了充足的或除EV的10%熱滅活胎牛血清，1% HEPES緩沖液，1%青霉素-鏈霉素和1% L-谷氨酰胺。

細胞在5% CO2條件下在37℃培養(yǎng)。硅球(SS, NanoFCM)是包含直徑68 nm, 91 nm, 113 nm和151 nm的二氧化硅球混合物。分別購買了直徑70 nm、90 nm、125 nm和150 nm的聚苯乙烯球(PS，Thermo Fisher)，以同樣的濃度混合。

二、凝膠排阻色譜(SEC)

取每個細胞系共60 ml條件培養(yǎng)基以1000×g 4℃離心5分鐘去除細胞和細胞碎片。用Centricon Plus-70離心過濾器(Millipore Sigma)將初始體積濃縮到1.5 ml。尺寸排除色譜(SEC)采用 qEV Automated Fraction Collectors(AFC，Izon)和 qEV original 70 nm columns (Izon)。色譜柱在室溫下放置30分鐘，用PBS洗滌。在三個柱上分別加0.5 ml濃縮后的培養(yǎng)基，再加PBS收集0.5 ml產(chǎn)物。將3個色譜柱得到的EV富集的部分匯合（每個樣本同樣操作），用3 kDa MWCO Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters 進一步濃縮到1ml。分裝成50 ?l用于下游檢測。

三、微分超速離心法(dUC)

取每個細胞系共60 ml條件培養(yǎng)基以1000×g 4℃離心5分鐘去除細胞和細胞碎片。再以2000×g 4?C離心10分鐘去除額外碎片。將上清液轉(zhuǎn)移到聚丙烯薄壁超離心(UC)管中，并在4?C下使用 swinging bucket rotor(Thermo Scientific，轉(zhuǎn)子AH-629)在10000 × g下離心30分鐘，使大EVs聚集。將上清液轉(zhuǎn)移到新的聚丙烯薄壁UC管中，在4℃相同的轉(zhuǎn)子下，10萬×g離心70分鐘，用1mlPBS重懸，漩渦震蕩，放在冰上20分鐘。分裝成50 ?l用于下游檢測。

四、透射電鏡(TEM)

10?l新鮮解凍的等份吸附于放光碳包覆400目銅格柵上，2分鐘后，用3滴1× tris緩沖鹽水(1分鐘1滴)快速吸附和漂洗網(wǎng)格。用1%醋酸鈾酰(UAT)+ tylose(1% UAT+去離子水(dIH2O)，0.22?m過濾2次)連續(xù)滴2滴到網(wǎng)格上進行負染，印跡，然后快速抽吸，用薄層染色劑覆蓋樣品。用AMT XR80 CCD(800萬像素)在Hitachi 7600 TEM 進行成像。SS和PS用如上方法吸收，但需要先進行5分鐘的浮選，并在80kv下使用AMT XR80 CCD(800萬像素)在Phillips CM-120 TEM上成像。

五、免疫印跡(WB)

H9和U937細胞團和分離的EVs用含蛋白抑制劑cocktail的1×RIPA裂解。用Pierce BCA蛋白測定試劑盒對細胞和EV裂解物進行蛋白定量。將5?g的裂解物用4%至15%的標準TGX無染預(yù)制凝膠溶解，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。一抗分別為抗CD81、CD63、CD9、TSG101、calnexin、BiP/GRP78和GM130。二抗分別為兔抗小鼠IgGk BP-HRP和小鼠抗兔IgGk BP-HRP。使用SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate進行檢測，并使用iBright Western Blot (Thermo Fisher)成像系統(tǒng)對印跡進行可視化。

六、單粒子干涉反射成像(SP-IRIS)

通過 SEC或dUC分離的35?l 9H和U937的EVs孵育緩沖液(IB)1:1稀釋，室溫下在ExoView R100(NanoView)的芯片上（包被有 anti-human CD81 (JS-81), anti-human CD63 (H5C6), anti-human CD9 (HI9a), and anti-mouse IgG1 (MOPC-21)抗體）孵育16 h，用IB清洗芯片4次，每次3分鐘，500 rpm平緩水平攪拌。然后用抗人CD81 (JS-81, CF555)、抗人CD63 (H5C6, CF647)和抗人CD9 (HI9a, CF488A)的熒光抗體cocktail（1:1200 稀釋）在IB和阻斷緩沖液的1:1混合液中室溫孵育1小時。然后只用IB洗1次，用洗滌液洗3次，用漂洗緩沖液洗1次(500 rpm下各3分鐘)。芯片在沖洗緩沖液中浸泡兩次，每次約5秒，然后以45度角取出，以使液體排出芯片。所有試劑和抗體均由NanoView Biosciences 提供。在ExoView芯片上，SS和PS都用dIH2O稀釋（每個抗體捕獲點約10000個顆粒）。共35ul稀釋后樣品溶液在ExoView芯片上孵育，并允許完全干燥。所有芯片都通過干涉反射成像和熒光檢測在ExoView掃描儀(NanoView)中進行成像。使用NanoViewer 2.8.10軟件(NanoView)對數(shù)據(jù)進行分析。熒光通道如下:CF555通道230、CF488通道475、CF647通道250(生物顆粒)和CF555通道675、CF488通道600和CF647通道375 (SS和PS)。

七、納米顆粒跟蹤分析(NTA)

ZetaView QUATT-NTA Nanoparticle Tracking-Video Microscope PMX-420 和 BASIC NTA-Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 (Particle Metrix)儀器用于散射和熒光(488 nm)模式的顆粒定量。校準珠和生物樣品分別在蒸餾水和PBS中稀釋至最終體積為1 ml。散射和熒光測量均進行校準。用于散射模式校準，將100 nm PS珠1:25萬稀釋。細胞溫度保持在25℃。將488 nm的黃綠色熒光球以1:25萬稀釋，分別測定散射和熒光。為了測量SS和PS的混合物和PS的尺寸分布，樣品被稀釋到每幀至少可以計數(shù)200個顆粒。每個樣本都進行重復(fù)測量。每次測量之間使用dIH2O洗滌。對于SEC或dUC分離的H9和U937 EVs，通過掃描11個細胞位置進行一個循環(huán)。使用ztaview軟件8.5.10對錄制的視頻進行分析。由于粒子的亞群也可以根據(jù)信號強度進行識別，我們在ZetaView軟件中使用manual and population distribution gates來評估SS和PS混合物的這種可能性。采用PE偶聯(lián)小鼠抗人CD81和AF488偶聯(lián)小鼠抗人CD63進行EVs的熒光檢測。將抗體與PBS 1:9 混合，室溫孵育2小時，稀釋至最終體積為1 ml。補充表2列出了該平臺檢測的所有抗體。

八、微流控電阻式脈沖傳感（MRPS）

使用nCS1儀器(Spectradyne)進行微流控電阻脈沖傳感測量。對于生物樣本，幾微升 H9和U937的EVs用同等體積的1%吐溫20+1×PBS (PBST)并進一步用1×PBS稀釋，加到polydimethylsiloxane cartridges(直徑范圍65 nm - 400 nm)。每個樣本和重復(fù)使用不同的cartridges。使用大約5?l的稀釋樣品，每次分析記錄約25000個顆粒。對于合成的納米顆粒，SS和PS在dIH2O中按體積稀釋100倍，然后用等體積的PBST稀釋10倍，剩下的用1×PBS，加入TS-400 polydimethylsiloxane cartridges中。每次記錄大約3000個顆粒。所有結(jié)果均使用nCS1數(shù)據(jù)分析儀(Spectradyne)進行分析。對所有樣本采用自定義濾波，根據(jù)經(jīng)過時間和直徑定義二維多邊形邊界，以排除假陽性信號，類似于流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)分析中常用的圈門。通過將樣品在Tween 20(PBS中)稀釋到最終濃度 0.1%到 0.9%.，評估Tween 20對EV完整性或計數(shù)的影響。

九、納米流式檢測(NFCM)

nFCM納米流式檢測儀用于測量顆粒的濃度和尺寸。兩個單光子計數(shù)雪崩光電二極管(APDs)用于同時檢測側(cè)面散射(SSC)和單個粒子的熒光。分別使用200 nm PE-和AF488熒光偶聯(lián)的PS球和二氧化硅納米球cocktail對儀器進行了校準。分別將20?lEVs 與20?l PE-conjugated CD81抗體和5?l AF488-conjugated CD63抗體37℃孵育30分鐘。然后PBS洗兩次，110000 g×4℃離心70分鐘（TH-641轉(zhuǎn)子，Thermo Fisher）用50?l PBS重懸顆粒。記錄1分鐘。利用校準曲線，將流速和散射強度轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的顆粒濃度和大小。

十、動態(tài)光散射(DLS)

為檢驗PS球的公稱尺寸值，使用Malvern Zetasizer Nano-ZS90用動態(tài)光散射法測量了粒徑。每種懸液在超純水中稀釋10倍，在25℃條件下進行3次測量。每一次運行只觀察到一個峰值。

結(jié)果展示：

最后一張圖是總結(jié)對比。

有興趣的話可以自己找這篇文獻具體看，或者私聊我要文獻資料，有理解得不對的地方，歡迎專業(yè)人士指正，一起交流~

參考文獻：

[1]Arab, T; Mallick, ER; Huang, Y; et al.Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms.[J].J Extracell Vesicles.2021,10(6):e12079

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