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PCR點(diǎn)突變質(zhì)粒相關(guān)疑問
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我現(xiàn)在在做單點(diǎn)突變的質(zhì)粒，是利用PCR去實(shí)現(xiàn)的。 現(xiàn)在有兩種做法： 1.直接上下游設(shè)計(jì)引物，上游為突變位點(diǎn)三個(gè)堿基帶兩邊各15bp，下游為突變位點(diǎn)前30bp。primestar 的fastpfu使用，以質(zhì)�；蛘呔簽槟０迦U(kuò)增。然后直接往商用感受態(tài)轉(zhuǎn)化.整體載體使用的是pet30a帶T7啟動(dòng)子終止子，共6000多bp，目的片段為1176bp。95 5 95 18s 55 18s 72 3.30m。 2.第二，按照之前的體系，但單獨(dú)加入單引物進(jìn)行單引物pcr，加入的質(zhì)粒小于50ng，后加入dpn I消化一小時(shí)。后混合，94 10m ，37 40m孵育。 使用的抗性為卡那抗性。 想問的有三個(gè)問題： 1.這樣的方法是否存在原模板未消化干凈之外的假陽性？ 2.方法一會產(chǎn)生部分無法自連的兩段帶有引物同源片段的長鏈，約6000bp也是，這個(gè)轉(zhuǎn)入后是否會產(chǎn)生抗性？ 3.菌落pcr有時(shí)能做出，有時(shí)候不能，是否做不出來就代表是假陽性？有的之前做出來了測序有結(jié)果是對的，挑取后搖起來，菌液直接做pcr結(jié)果沒結(jié)果。送菌液或者自己提取質(zhì)粒后送測序是否更好？ 4.這個(gè)質(zhì)粒能在菌里大概保存幾代?不會我今天測序，明天挑了搖起來就沒有了吧。搖起來后能否就用搖起來的菌再傳代提質(zhì)粒 ？ |
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