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液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜基質(zhì)效應及其消除方法總結
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大氣壓電離技術的發(fā)展使高效液相色譜與質(zhì)譜的串聯(lián)得以實現(xiàn)。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是將高效液相色譜的高分離度與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度的完美結合, 近年來發(fā)展迅速, 現(xiàn)在已廣泛應用于醫(yī)藥、食品安全等領域。但是, 由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜存在基質(zhì)效應, 給復雜生物樣品分析方法的建立帶來了不少困擾。 基質(zhì)效應可對方法的定量限(LOQ)、檢出限(LOD)、線性、準確度和精密度產(chǎn)生嚴重的影響。基質(zhì)是樣品中被測物以外的組分, 常對被測物分析有顯著的干擾, 并影響測定結果的準確性, 這些干擾和影響被稱為基質(zhì)效應�；|(zhì)效應表現(xiàn)為離子抑制或離子增強。 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中的基質(zhì)效應產(chǎn)生的原因一般認為是由于基質(zhì)中的非揮發(fā)性組分與待測物質(zhì), 在霧滴表面離子化的過程中產(chǎn)生競爭, 影響電噴霧接口處的離子化效率。這些非揮發(fā)性的基質(zhì)組分將霧滴吸引在一起, 阻止其裂解成更小的微滴。根據(jù)接口處離子化和離子蒸發(fā)過程中的變化情況, 這種競爭可能會增強(離子增強)或者妨礙(離子抑制)被分析物離子的形成效能, 也就是說被分析物離子的形成效能與進入電噴霧離子源的基質(zhì)密切相關。也有人認為基質(zhì)效應是由于待測組分與基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)共洗脫而引起的色譜柱超載所致。 產(chǎn)生基質(zhì)效應的干擾性物質(zhì)分為兩類。一類叫做“內(nèi)源性物質(zhì)”: 它源自于被分析物本身, 并保留在最終提取液中的物質(zhì), 包括鹽、強極性化合物、表面活性劑以及與目標化合物結構類似的脂類、胺類、肽類等。另一類叫做“外源性物質(zhì)”: 它并非來自基質(zhì)本身, 而是來源于方法建立過程中外部環(huán)境, 包括塑料和聚合物殘留、離子對試劑、有機酸、緩沖溶液等。因此, 在方法建立過程中,全面了解基質(zhì)效應的消除(或最小化)方法至關重要。目前, 在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法建立過程中詳細說明基質(zhì)效應消除方法的文章在國內(nèi)還較少。消除基質(zhì)效應的方法有: (1) 選擇合適的樣品前處理方法; (2) 選擇合適的色譜分離條件; (3) 優(yōu)化質(zhì)譜分析條件; (4) 使用合適的內(nèi)標; (5) 采用基質(zhì)標準溶液校正。 1、選擇合適的樣品前處理方法 樣品溶液上機前提取、凈化的程度, 決定了樣品溶液中基質(zhì)成分以及殘留數(shù)量的不同, 從而導致不同程度的基質(zhì)效應。因此, 樣品前處理方法的選擇直接影響基質(zhì)效應的強度。傳統(tǒng)的消除基質(zhì)效應的前處理方法有: 蛋白質(zhì)沉淀(PPT)、液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、樣品稀釋(或減少進樣量)等。 對蛋白質(zhì)沉淀、液液萃取、固相萃取(反相固相萃取柱、離子交換柱、混合型固相萃取柱)等幾種常規(guī)的樣品前處理方法進行了比較。結果顯示, 蛋白質(zhì)沉淀方法的效果最差; 其次是反相固相萃取和離子交換固相萃取; 效果最好的是兼具反相和離子交換機理的混合型固相萃取柱; 液液萃取也可以達到較好的凈化效果, 但是對于極性化合物的回收率較低。在使用了混合型離子交換柱, 使液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法檢測人體血液中的美沙特羅殘留量的基質(zhì)效應降到最低。在此兩組實驗中, 對于這幾種常規(guī)的前處理方法, 混合型固相萃取柱的凈化效果最佳。同時, 固相萃取柱上樣前的處理以及淋洗、洗脫條件的不同, 都會導致最終基質(zhì)效應的不同。比較硅膠基質(zhì)和聚合物基質(zhì)的反相固相萃取柱, 結果表明, 對于這兩種固相萃取柱, 以甲醇魏洗脫液, 減少干擾物磷脂的洗脫, 必須減小洗脫液中甲醇的比例, 而對于硅膠基質(zhì)反相固相萃取柱 100%的乙腈可以顯著降低干擾物磷脂的洗脫,同時, 使目標物得到最佳的回收率。因此, 使用硅膠基質(zhì)固相萃取柱, 以乙腈洗脫, 使實驗達到最佳效果。 在上述研究中, 固相萃取柱作為最有效的消除基質(zhì)效應的方式應用于實驗中。但是, 對于不同分析物, 還要通過實驗來確定最優(yōu)(基質(zhì)效應影響最小)的前處理方法。對尿液、口腔液、血漿中的違禁藥進行檢測, 根據(jù)各種前處理方式對不同基質(zhì)的凈化效果、不同樣品的預期濃度、最低檢出限要求,確定不同的基質(zhì)效應消除方法。尿液采用稀釋的前處理方法, 口腔液采用乙腈沉淀蛋白質(zhì)的前處理方法, 血漿采用固相萃取的前處理方法, 均達到最佳效果。比較兩種前處理方法對 LC-MS/MS 測定家兔血清中淫羊藿黃酮類化合物基質(zhì)效應的影響。以乙酸乙酯液－液萃取法進行樣品前處理后, 家兔血清中淫羊藿黃酮類化合物的絕對基質(zhì)效應大于100%, 提取回收率和方法過程效率均較高且穩(wěn)定; 以 C18 小柱固相萃取法進行樣品前處理后, 家兔血清中淫羊藿黃酮類化合物的絕對基質(zhì)效應低于 100%, 提取回收率和方法過程效率均較低且不穩(wěn)定。因此, 采用乙酸乙酯液－液萃取法, 適合作為樣品前處理方法。 近年來, 出現(xiàn)了許多新型的前處理方法, 例如, 在線前處理技術的發(fā)展, 使得基質(zhì)效應有了新的、更高效的解決方式。在線固相萃取(SPE)、渦流色譜技術(turbulent flow, TFC), 與傳統(tǒng)的前處理方式相比具有速度快, 回收率高, 成本低的特點。這種方式在近年來文獻中已有很多報道。 2、選擇合適的色譜分離條件 由于 LC-MS/MS 分析中的基質(zhì)效應是由被分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率所致。因此, 合理的色譜分離條件, 使目標物與干擾物分離,即可有效改善基質(zhì)效應的影響。流動相的 pH值可改變目標物與雜質(zhì)的保留行為, 且不同的 pH 值可改變離子源的電離行為, 因此合理調(diào)節(jié)流動相的 pH 值可改善基質(zhì)效應的影響, 提高靈敏度。同時, 研究發(fā)現(xiàn)縮短流動相的梯度洗脫時間, 在不同 pH 值條件下, 不同程度的增加了阿米替林的基質(zhì)效應。因此, 延長梯度時間, 使目標物與雜質(zhì)有效分離, 可改善基質(zhì)效應的影響。 同時, 由于不同種類色譜柱的分離效果不同, 也會對基質(zhì)效應產(chǎn)生不同的影響, 例如, 使用HILIC色譜柱與反相色譜柱相比可以有效的延長極性化合物的保留時間, 有效的除去雜質(zhì)分子, 避免基質(zhì)效應, 同時 HILIC 色譜柱使用的高比例揮發(fā)性有機相亦有助于質(zhì)譜響應值的提高, 因此選擇合適類型的色譜柱進行樣品分析至關重要。通過實驗比較了 HPLC 和 UPLC 分別串聯(lián)質(zhì)譜分析地表水中9 種藥物的基質(zhì)效應。在HPLC-MS/MS 分析中, 色譜分離效率低, 無法消除基質(zhì)效應的影響, 使定量不準。UPLC-MS/MS 擁有更好的分離度和更窄的峰型, 使分析物與共流出物更好的分離, 以類似物為內(nèi)標, 消除了基質(zhì)效應的影響。另外,有研究亦表明, 基質(zhì)效應的大小直接依賴于色譜分離性。 運用二維色譜, 使目標物與雜質(zhì)更有效的得到分離, 從而, 使基質(zhì)效應得到明顯改善。二維液相色譜是運用了柱反沖技術, 即第一根色譜柱將待測組分保留在色譜柱上, 基質(zhì)組分不被保留而除去,然后將第一根色譜柱上的待測組分反沖到第二根色譜柱進行分離。 3、優(yōu)化質(zhì)譜分析條件 實驗表明, 多數(shù)化合物基質(zhì)效應對ESI影響顯著, 而對于 APCI、APPI 的影響很小或者沒有影響。因此在儀器條件允許的情況下, 合理選擇離子源, 是簡便有效的消除基質(zhì)效應的方法。 4、使用合適的內(nèi)標 同位素內(nèi)標是消除基質(zhì)效應首選的內(nèi)標物, 同位素內(nèi)標與目標物具有相同的化學性質(zhì)和相同的保留時間, 因此可以抵消質(zhì)譜離子化過程中的基質(zhì)效應, 同時消除前處理過程中的差異。但是, 一些同位素內(nèi)標難以合成或價格昂貴, 使同位素內(nèi)標的應用受到一定的限制。 使用類似物做為內(nèi)標, 在合理的試驗條件下, 亦得到了滿意的效果。 5、采用基質(zhì)標準溶液校正 基質(zhì)標準溶液, 即將空白樣品經(jīng)前處理后, 加入一定量待測物標準, 用以對檢測結果進行校正。采用基質(zhì)標準溶液校正, 是最常用的補償基質(zhì)效應的方法。在國內(nèi)外液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法研究中應用十分廣泛。綜上所述, 在具體的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法開發(fā)過程中, 首先要根據(jù)目標化合物的性質(zhì)、基質(zhì)類型、檢出限要求等對前處理方法進行優(yōu)化, 比較多種前處理方法的凈化效果, 兼顧基質(zhì)效應和回收率, 盡可能多的消除可引起基質(zhì)效應的內(nèi)源性物質(zhì); 其次選擇合適的離子源并對色譜條件進行優(yōu)化, 以得到最優(yōu)的分離效果, 避免共流出物的影響。選擇合適的內(nèi)標物、采用基質(zhì)標準溶液校正是對產(chǎn)生的基質(zhì)效應的補償, 以抵消基質(zhì)效應的影響, 是在前處理以及儀器條件無法消除基質(zhì)效應的情況下的補償措施, 以保證檢測結果的準確性。 |
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