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實(shí)驗(yàn)篇之RT-PCR
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逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)作為是常見(jiàn)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)之一，雖然看上去步驟簡(jiǎn)單，但當(dāng)你實(shí)際操作時(shí)就會(huì)發(fā)現(xiàn)各種問(wèn)題撲面而來(lái)，相信各位小伙伴都有被一個(gè)簡(jiǎn)單的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)搞得頭暈眼花的時(shí)候，今天就由小編給大家介紹一下逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)和常見(jiàn)問(wèn)題，希望大家學(xué)以致用哦！ 逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）是以 RNA 為模板合成 DNA 的過(guò)程，即 RNA 指導(dǎo)下的 DNA 合成，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)包括3大要素，分別是引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和 RNA 模板： 1. 引物：逆轉(zhuǎn)錄引物主要有3種，包括 Oligo（dT）、Random Primers 和基因特異性引物（GSP）。其中 Oligo（dT）具有12-20個(gè) T 堿基，并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對(duì)，可合成全長(zhǎng)的 cDNA，但僅擴(kuò)增有 polyA 尾的 mRNA ，對(duì)模板質(zhì)量要求高，較適合克隆實(shí)驗(yàn)。而 Random Primers 具有6-9個(gè)堿基，可隨機(jī)識(shí)別模板并結(jié)合，適合復(fù)雜結(jié)構(gòu)和微量模板，但特異性低，小片段多，適合后續(xù) qPCR 實(shí)驗(yàn)�；蛱禺愋砸锟梢宰R(shí)別特定模板序列，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高的特點(diǎn)，但需合成特定的序列。所以根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求可進(jìn)行相應(yīng)引物的選擇。 2. 逆轉(zhuǎn)錄酶：一種是來(lái)自純化的禽成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV），由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強(qiáng)的 RNaseH 活性，它最適溫度是42℃，最適 pH8.3，在高反應(yīng)溫度時(shí)可消除 mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的阻礙，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產(chǎn)生也限制其長(zhǎng)度。另一種來(lái)源于鼠白血病病毒（M-MLV），是單肽鏈的，有 RNA 聚合酶活性和相對(duì)較弱的 RNaseH 活性，最適溫度37℃，最適 pH7.6，較弱的 RNaseH 活性對(duì)獲得2-3kb的 mRNA 的全長(zhǎng) cDNA 有很大好處。 3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 的完整度，完整的總 RNA 在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生清晰的28S 和18S rRNA 條帶（真核樣品），28S rRNA 條帶的強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)大致為18S rRNA 條帶的兩倍，并且無(wú) gDNA 和蛋白殘留。 上面給大家簡(jiǎn)單介紹了一下逆轉(zhuǎn)錄的3大要素，除此之外在實(shí)際的操作過(guò)程中，還會(huì)有各種各樣的讓問(wèn)題我們措手不及，下面給大家一一詳細(xì)解答！ 1. 如何提高 RT-PCR 反應(yīng)的靈敏度與特異性？ ① 確定模板 RNA 完整性好，無(wú) DNA 污染。 ② RNA 模板中不應(yīng)含有擴(kuò)增反應(yīng)抑制劑。 ③ 使用適量的模板 RNA ，模板量太多會(huì)降低特異性，太少會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增不出條帶或條帶太弱。 ④ 若模板中有二級(jí)結(jié)構(gòu)，可通過(guò)提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度來(lái)提高擴(kuò)增效果。 2. RNA 中含有逆轉(zhuǎn)錄抑制劑時(shí)，怎么處理？ 逆轉(zhuǎn)錄抑制劑包括：SDS 、EDTA 、甘油、焦磷酸鈉、亞精胺和胍鹽等等。可將已確定的高質(zhì)量 RNA 模板同樣品混合，同高質(zhì)量 RNA 模板比較產(chǎn)量以檢測(cè) RNA 抑制劑；若高質(zhì)量模板 RNA 與樣品混合后產(chǎn)量降低，則說(shuō)明樣品中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制劑，可用70%（v/v）乙醇對(duì) RNA 沉淀進(jìn)行清洗，以除去抑制劑。 3. 逆轉(zhuǎn)錄后的 qPCR 實(shí)驗(yàn) Ct 值偏大或者普通 PCR 產(chǎn)量低。 ① RNA 模板質(zhì)量差，需要重新制備 RNA 模板，可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。 ② 逆轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 中含有高濃度的模板 RNA 和逆轉(zhuǎn)錄試劑成分，可能會(huì)對(duì)后續(xù)的PCR 產(chǎn)生抑制作用，所以可以適當(dāng)梯度提高 cDNA 稀釋比例（通常來(lái)說(shuō)可將 cDNA 原液稀釋5-10倍，其最佳模板加入量以擴(kuò)增得到的 Ct 值在20-30個(gè)循環(huán)為好）。 ③ 起始的 RNA 模板量低，需要減少稀釋倍數(shù)或增加 RNA 模板量。 ④ 基因本身原因（復(fù)雜和長(zhǎng)度），可以重新設(shè)計(jì)復(fù)雜基因的引物，避免復(fù)雜結(jié)構(gòu)。或者用三步法程序或延長(zhǎng)兩步法程序的延伸時(shí)間。 ⑤ 逆轉(zhuǎn)錄或者定量產(chǎn)品性能差，可以通過(guò)做平行不用品牌產(chǎn)品對(duì)比實(shí)驗(yàn)，對(duì)比逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品性能。 4. 逆轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增效率評(píng)估，應(yīng)該關(guān)注哪些指標(biāo)？ 建議： qPCR-ct 值，或者 PCR 產(chǎn)量 如果想比較逆轉(zhuǎn)錄性能，最為直接的還是后續(xù)做 qPCR 或者 PCR 平行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，這種方法相對(duì)較為準(zhǔn)確。 不建議：cDNA 中間產(chǎn)物濃度測(cè)定 or 其他方法。 逆轉(zhuǎn)錄完成后是不建議測(cè)定產(chǎn)物濃度的，由于逆轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生 RNA-cDNA 雜交鏈，溶液中的 RNA 和部分 DNA 會(huì)對(duì)吸光值產(chǎn)生影響，所以測(cè)定出來(lái)的產(chǎn)物濃度并不準(zhǔn)確，即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的試劑盒進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，由于不同品牌之間的逆轉(zhuǎn)錄體系具有或多或少的差異，其體系中的各種離子等都能對(duì)吸光度產(chǎn)生影響，所以測(cè)定的結(jié)果也沒(méi)有可比性。 優(yōu)化及注意事項(xiàng) ① 逆轉(zhuǎn)錄 PCR 時(shí)，提取 RNA 是關(guān)鍵，需分離高質(zhì)量 RNA（純度和完整性）。 ② 整個(gè)操作過(guò)程需使用去 RNA 酶的槍頭、EP 管等耗材。 ③ 逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中要謹(jǐn)防 RNA 酶的污染，加入 RNA 酶抑制劑。 ④ 為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照。 ⑤ 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)應(yīng)全程在冰上操作完成，操作過(guò)程應(yīng)避免 RNase 污染。 ⑥ 提高逆轉(zhuǎn)錄預(yù)熱溫度（也可根據(jù)相應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行調(diào)整）。 ⑦ 減少基因組 DNA 污染，可使用去基因組的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。 （來(lái)源：先達(dá)基因（gendx.cn）） |
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