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核酸檢測實驗室（PCR）如何消毒？
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摘要：PCR實驗，即臨床基因擴增實驗，是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段 PCR實驗，即臨床基因擴增實驗，是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將病毒體內(nèi)所含的基因進行擴增的方法，測出一些病毒含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。 而三級綜合醫(yī)院不具備核酸檢測能力的少之又少，大多已經(jīng)實現(xiàn)了PCR實驗的基本要求，差別只在于開展項目略有不同，這項要求真正難以落實的主要問題是：二級醫(yī)院/縣醫(yī)院建立PCR實驗室不容易。 就新冠病毒核酸檢測來說，RT-PCR是目前使用廣泛和較準(zhǔn)確的篩選和確認(rèn)方法，大規(guī)模核酸檢測，必然會引起相關(guān)機構(gòu)單位著力建設(shè)規(guī)范的臨床PCR實驗室。但是，建立一個PCR實驗室，其實就是在建設(shè)一個平臺，考驗的不僅僅是一個醫(yī)療機構(gòu)的實驗?zāi)芰�，也考驗著整個醫(yī)療機構(gòu)的整體能力。下面就為大家整理一下PCR實驗室建設(shè)及日常管理方面的一些問題。 一、臨床基因擴增檢驗實驗室設(shè)計的核心問題是什么？ 實驗室的平面布局、空調(diào)通風(fēng) 系統(tǒng)設(shè)計、氣流控制等都是圍繞同一個核心問題進行——“避免污染”，任何級別的醫(yī)院在建設(shè)PCR實驗室時，均需要提前考量各個因素，以保證標(biāo)本的全環(huán)節(jié)質(zhì)量及實驗室的生物安全。 1、建設(shè)要求。PCR實驗室的建設(shè)需要設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)的“四區(qū)”：試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、PCR擴增檢測區(qū)和擴增產(chǎn)物檢測區(qū)。每個獨立實驗區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個PCR實驗過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染，并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。 2、人員要求。進入PCR實驗室，需要經(jīng)過從基礎(chǔ)理論、實驗原理、規(guī)范操作、質(zhì)量保證到注意事項等規(guī)范的培訓(xùn)，并獲取PCR上崗證。 3、檢測風(fēng)險。檢測過程中，樣本的開蓋，核酸提取的震蕩、離心都有可能產(chǎn)生氣溶膠，有感染的風(fēng)險。 4、防護要求。必須按照生物安全三級實驗室的個人防護要求進行。 二、PCR實驗的污染來源都有哪些？ 1、樣本間交叉污染：收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴(yán)導(dǎo)致外溢；不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌；不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復(fù)吹吸導(dǎo)致氣溶膠形成擴散，相互交叉污染。 2、實驗試劑污染：主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中，由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。加樣過程中，因為PCR試劑對溫度十分敏感，需要通過冰浴使得PCR試劑和PCR板/管處于0℃，但這個過程也充滿污染風(fēng)險。 3、擴增產(chǎn)物污染：大量拷貝的產(chǎn)物泄漏或擴增后的PCR反應(yīng)管意外開蓋，這是PCR反應(yīng)中主要、常見的污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。 4、克隆質(zhì)粒污染：作為陽性質(zhì)控品的克隆質(zhì)粒外溢。 三、防止實驗污染都有哪些措施？ 對于低流行地區(qū)，PCR檢測人員經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)上崗后，核酸污染的風(fēng)險相對較小，但在疫區(qū)超負(fù)荷工作時，就可能會遇到核酸污染的問題，可通過以下措施降低污染機會： 1、正確佩戴手套：手套未緊密貼合拇指、食指和中指，在進行開蓋操作時容易發(fā)生交叉污染。 2、正確使用生物安全柜：簡單、整潔、避免通風(fēng)口堵塞；操作前后紫外線照射，消毒劑隨手可及；廢液缸里有1/3體積的含氯消毒液，并且及時清理廢液缸，保證廢物不超過廢液缸體積的2/3。 3、核酸提取儀去污染：每天多批次檢測時，在每一批次檢測完以后必須用75%的乙醇和核酸去除劑對儀器進行去污染。 4、重視通風(fēng)：不定期對房間進行通風(fēng)，每次至少持續(xù)30min。 5、PCR擴增區(qū)去污染：PCR反應(yīng)管必須蓋緊，避免擴增后的核酸對環(huán)境的污染。 6、實驗室隨手可及的消毒劑。 四、PCR實驗室的空氣流向管理與環(huán)境消毒？ 前面提到，PCR實驗室可分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴增區(qū)和產(chǎn)物檢測區(qū)四個區(qū)域，這四個區(qū)域在物理空間上必須完全相互獨立，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。所以，臨床基因擴增檢驗實驗室的空氣流向應(yīng)按：試劑準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴增區(qū)→產(chǎn)物檢測區(qū)，應(yīng)時刻防止擴增產(chǎn)物順空氣氣流進入擴增前區(qū)域。可按照上述順序區(qū)域空氣壓力遞減的方式進行，也可通過安裝排風(fēng)扇、負(fù)壓排風(fēng)裝置或其他可行方式實現(xiàn)。 臨床基因擴增檢驗實驗室的環(huán)境清潔：《臨床基因擴增實驗室工作規(guī)范》中有對物表清潔、消毒的要求，不同的實驗區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。 （1）基本原則：由清潔區(qū)向污染區(qū)進行，潔具不可交叉。 （2）清潔消毒方向：準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴增區(qū)→產(chǎn)物檢測區(qū)。 （3）清潔消毒范圍：工作區(qū)域的物體表面(含桌、椅)，可使用含氯消毒劑擦拭消毒，空氣和工作臺面可使用紫外線照射消毒，也可使用空間消毒器進行全環(huán)節(jié)消毒。不可使用紫外線消毒器及化學(xué)消毒進行有人狀態(tài)下的消毒。PCR室內(nèi)的消毒應(yīng)防止揚塵（減少人員走動）、殺滅DNA或RNA的基因片段�？蛇x擇懸掛紫外線燈管進行空氣消毒，試驗前照射30-60分鐘，實驗結(jié)束照射30-60分鐘，必要時延長照射時間（可照射一夜）。 （4）終末消毒：當(dāng)出現(xiàn)實驗室污染時，應(yīng)按要求立即撤出相關(guān)人員，在無人情況下可使用化學(xué)消毒劑進行終末消毒，如熏蒸法：過氧乙酸1g/ m3加熱熏蒸（濕度70-90%），密閉24小時；氣溶膠噴霧：3%過氧化氫：20mL/m3氣溶膠噴霧；5%過氧乙酸2.5mL/m3氣溶膠噴霧（濕度20-40%）。 五、日常清潔消毒應(yīng)該如何做？ 1、每日工作前后，對工作區(qū)域表面、地面進行清潔并消毒，使用含氯消毒液擦拭。清潔采用濕式、不揚塵的方式進行。 2、物品防塵存放。墻面定期清潔，有可見污染及時進行清潔消毒。配備移動紫外線消毒裝置進行空氣和物表的消毒。 3、生物安全柜的消毒： （1）每天工作前：對生物安全柜的內(nèi)表面進行消毒，包括工作臺面和內(nèi)壁使用消毒劑擦拭； （2）工作結(jié)束：柜內(nèi)物品全部消毒后移出。消毒劑擦拭臺面四周、以及玻璃內(nèi)側(cè)燈部位； （3）停用生物安全柜前：運行5min以凈化內(nèi)部空氣； （4）消毒劑應(yīng)選擇能夠殺死生物安全柜里可能發(fā)生的任何微生物（70%乙醇、含氯消毒劑）。在使用漂白劑等腐蝕性消毒劑后，還應(yīng)用無菌水再次進行擦拭； （5）終末消毒：需要進行終末消毒的時機。 六、試驗完成后，物品及環(huán)境如何處理？ （1）做好廢液及固廢處理； （2）實驗室空間消毒：在室溫，50-60%濕度條件下，使用過氧乙酸熏蒸2g/m3，過夜；或使用20g/l氣溶膠噴霧，用量8g/m3； （3）物體表面消毒液：0.55%含氯消毒劑，現(xiàn)用現(xiàn)配，24小時內(nèi)使用。 七、疫情時期的核酸檢測新要求 從以上描述不難看出，在當(dāng)前PCR核酸檢測實驗室，還是有相當(dāng)多的約束條件，在需要緊急使用時也是需要較長的準(zhǔn)備時間，同時也無法滿足當(dāng)前機場、口岸、社區(qū)等基層大規(guī)模檢測的需要和疫情防控的要求，影響了對患者的及時診斷和治療。面對新冠病毒此類的疫情防控，急需一種快速、準(zhǔn)確、便捷的檢測手段！ 這時等溫擴增技術(shù)也開始出現(xiàn)在更多科研人員的視野中，它不需要專門的實驗室，操作人員也不用專業(yè)的培訓(xùn)，整體價格也不會特別的昂貴，比如先達基因（gendx.cn）的ERA等溫擴增技術(shù)，該方法在低溫條件下（25-42℃）可對痕量的靶DNA片段進行特異性的擴增，在最適溫度35-42℃時，擴增反應(yīng)時間僅需15分鐘，其低溫適應(yīng)性和靈敏度等方面取得了重大突破，這也就為核酸檢測走出實驗室創(chuàng)造了條件。 該公司將體外逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)（RT）與自主開發(fā)的獨特等溫擴增熒光檢測(ERA)技術(shù)進行融合開發(fā)出全新的RT-ERA技術(shù)，根據(jù)新型冠狀病毒編碼Spiker基因的特異性核苷酸序列設(shè)計1對引物和熒光探針建立的檢測新型冠狀病毒的核酸熒光定量擴增方法大量擴增后的產(chǎn)物能夠與帶有熒光標(biāo)記的探針相結(jié)合，從而產(chǎn)生特定的熒光。該熒光信號可由熒光檢測儀器實時捕獲，直觀反映擴增循環(huán)情況。 樣品中如果具有微量的新型冠狀病毒RNA存在時，則能夠通過大量擴增后激發(fā)熒光信號，樣本顯示為陽性；如果樣本中不含有新型冠狀病毒，儀器會判讀為陰性。以此做到快速，簡單，準(zhǔn)確的檢測核酸樣本。 同時我們也期待此類技術(shù)能更快的應(yīng)用于實踐中，努力做到更好的早發(fā)現(xiàn)，早隔離的防疫要求。 |
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