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ERA（酶促重組等溫擴(kuò)增）技術(shù)常見問題解答
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【ERA技術(shù)】 通過模擬生物體遺傳物質(zhì)自身擴(kuò)增復(fù)制的原理，將來源于細(xì)菌，病毒和噬菌體的特定重組酶、外切酶、聚合酶等多酶體系進(jìn)行改造突變并篩選其功能，通過不同的核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化組合，從而獲得核心的重組等溫擴(kuò)增體系，在37-42℃恒溫條件下，可將微量DNA/RNA的特異性區(qū)段在數(shù)分鐘內(nèi)擴(kuò)增數(shù)十億倍，即（酶促重組等溫擴(kuò)增，Enzymatic Recombinase Amplification）ERA技術(shù)方法。 1、ERA擴(kuò)增試劑盒應(yīng)在怎樣的溫度下使用？ 標(biāo)準(zhǔn)的ERA擴(kuò)增試劑盒經(jīng)過配制可在37℃-42℃的溫度范圍內(nèi)操作。過高的溫度會對反應(yīng)體系產(chǎn)生不利的影響，因?yàn)槊笗饾u地失去全部活性。對于RT試劑盒，我們建議客戶在40℃下運(yùn)行反應(yīng)，因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄酶在稍高溫度下具有更高的活性。 2、經(jīng)過一種ERA擴(kuò)增試劑盒測試過的引物，能直接用于其他ERA擴(kuò)增試劑盒嗎？ 不一定。如果您已設(shè)計篩選出ERA基礎(chǔ)型核酸擴(kuò)增試劑盒的引物，用于ERA熒光型或ERA試紙型核酸擴(kuò)增試劑盒時還需要引入探針。這個意味著跑膠檢測、熒光檢測或是測流層析檢測對引物的最佳組合可能有著不同的要求。通常情況下，使用相同的引物探針從ERA熒光型轉(zhuǎn)為ERA試紙型能獲得相當(dāng)可靠的結(jié)果，此時ERA試紙型熒光信號強(qiáng)度會大幅度減弱，但不會影響靈敏度檢測。熒光檢測的最佳引物/探針組合不一定是跑膠檢測的最佳引物組合，反之亦然。從DNA檢測分析轉(zhuǎn)為RNA檢測的逆轉(zhuǎn)錄分析情況更復(fù)雜，因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄酶對引物有著不同的偏好。就這一點(diǎn)而論，我們建議使用RT試劑盒在RNA模板上設(shè)計RNA檢測，而不是使用DNA試劑盒優(yōu)化后的結(jié)果嘗試轉(zhuǎn)為使用RT試劑盒。 3、當(dāng)我向擴(kuò)增試劑中加入事先配制好的預(yù)混液時，擴(kuò)增試劑變渾濁，這有問題嗎？ 這對于ERA反應(yīng)來說屬于正�，F(xiàn)象，沒有問題。ERA反應(yīng)會形成乳狀液，有時肉眼可觀察到此變化。 4、可以保存ERA擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物嗎？ 可以，基礎(chǔ)型、RT-基礎(chǔ)型、試紙型或是RT-試紙型反應(yīng)體系的擴(kuò)增產(chǎn)物短期可以保存在4℃下，長期保存建議-20℃。但熒光型（RT）擴(kuò)增產(chǎn)物不能保存。如果在反應(yīng)結(jié)束后未經(jīng)迅速失活處理，核酸酶會逐漸消化擴(kuò)增產(chǎn)物。 5、可以對EAR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行終點(diǎn)分析嗎？ 可以，但不包括熒光型（RT）試劑盒。因?yàn)樵诜磻?yīng)結(jié)束后，未經(jīng)迅速失活處理，核酸酶會逐漸消化擴(kuò)增產(chǎn)物。要分析擴(kuò)增產(chǎn)物，請使用基礎(chǔ)型（RT）或試紙型試劑盒進(jìn)行跑膠檢測分析。 6、可以將激活劑添加至重懸試劑中嗎？ 如果您在使用基礎(chǔ)型（RT）、試紙型（RT）反應(yīng)體系時，是可以添加的。 不過一旦加入激活劑，反應(yīng)體系立即被啟動。在最后添加激活劑時，我們建議將激活劑添加到8聯(lián)排反應(yīng)管的蓋子上，并將其離心至反應(yīng)體系中，這樣便可確保反應(yīng)同時開始。 如果您在使用熒光型（RT）反應(yīng)體系時，是不可以添加的。當(dāng)體系里面有激活劑存在時，引物和探針會受到核酸酶的破壞，便會導(dǎo)致反應(yīng)中出現(xiàn)很高的熒光基線。 7、可以在反應(yīng)體系中加入更多/更少的溶解劑嗎？ 不可以。加入比建議更多或更少的溶解劑會對ERA反應(yīng)的進(jìn)行方式產(chǎn)生不利的影響。溶解劑中包含ERA反應(yīng)所需的成分，因此加入更多或更少的溶解劑將會改變其在重懸試劑中的最終濃度。 8、可以制備預(yù)混液嗎？ 可以。如果您想建立多個反應(yīng)，可以制備預(yù)混液。在篩選不同的DNA時，可以將溶解劑、引物和探針（如果使用）混合在一起，并加到擴(kuò)增試劑中重懸。然后將不同的DNA加入反應(yīng)體系，最后照常激活劑啟動反應(yīng)。在篩選不同引物時，可以將溶解劑、模板DNA、探針（如果使用）和一個引物制成預(yù)混液，并將其分裝到1.5ml小管后再分別加入不同的引物。只有當(dāng)兩個引物都存在時，才能重懸擴(kuò)增試劑，否則會使重組復(fù)合物的形成偏向先添加的引物。 9、跑膠之前需要純化EAR擴(kuò)增產(chǎn)物嗎？ 需要。ERA反應(yīng)體系里的所含試劑和蛋白會干擾正常的瓊脂糖凝膠電泳，如果不進(jìn)行產(chǎn)物純化，跑出來的可能是彌散條帶而不是干凈的條帶。 10、如果要運(yùn)行ERA反應(yīng)，需要哪種類型的儀器設(shè)備？ 本公司有一款自主開發(fā)的GS8恒溫?zé)晒鈾z測儀，簡單便攜。基礎(chǔ)型（RT）和試紙型（RT）適用于任何能保持37-42℃的穩(wěn)定溫度的設(shè)備。對于使用熒光型（RT）試劑盒進(jìn)行實(shí)時反應(yīng)時，可使用能激發(fā)并檢測所用熒光基團(tuán)（最佳激發(fā)波長為492nM，最大發(fā)射波長為520nM）并能保持37-42℃穩(wěn)定溫度的儀器設(shè)備或?qū)崟r熱循環(huán)儀，注意，在運(yùn)行ERA反應(yīng)時，蓋加熱功能應(yīng)關(guān)閉。這里推薦使用本公司自主開發(fā)的GS8恒溫?zé)晒鈾z測儀，簡單便攜。也可使用ABI 7500，LightCycler480，CFX 96等熒光定量PCR儀。 11、使用ERA擴(kuò)增試劑時，我可以如何提高一致性和改善RNA靶基因的擴(kuò)增？ 如果模板RNA在添加到反應(yīng)之前先與激活劑合并，這可能使RNA的三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化，從而導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄酶受到抑制�，F(xiàn)將模板RNA添加到反應(yīng)混合液中再添加激活劑，或相隔一段距離（即RNA與激活劑分別添加到反應(yīng)蓋子的相對兩側(cè)）同時添加，這樣可提高性能。 12、出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，可能的原因有哪些？ 如果在無模板對照中觀察到假陽性結(jié)果，可能的原因主要有污染或引物設(shè)計引起。 1）通常由污染引起比較多見，現(xiàn)象為無模板對照或陰性對照的檢測結(jié)果顯示與陽性結(jié)果非常類似。以熒光檢測為例，具有擴(kuò)增曲線，熒光值較高一般為陽性值相差不大。對此，我們建議區(qū)分試劑配制區(qū)和擴(kuò)增分析區(qū)。在使用任何擴(kuò)增后打開反應(yīng)管的終點(diǎn)檢測方法時，必須采用嚴(yán)格的污染控制措施。要排除或清除污染，我們建議用消毒液或75%的酒精對工作區(qū)域進(jìn)行消毒，并使用新的擴(kuò)增試劑（溶解劑、激活劑等）�？赡苄枰貜�(fù)幾次清潔，才能徹底清除污染。 2）引物設(shè)計問題導(dǎo)致，現(xiàn)象為無模板對照或陰性對照的檢測結(jié)果顯示與陽性結(jié)果有較大的差異。以新冠檢測為例，一般出峰時間較晚（在13分鐘以后），熒光Δ值較低，擴(kuò)增曲線不明顯。針對此類問題，我們建議引物進(jìn)行重新設(shè)計和篩選。 |
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