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rui93614新蟲(chóng) (小有名氣)
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CRSPR Cas9技術(shù)做細(xì)菌的基因敲除相關(guān)問(wèn)題請(qǐng)教 已有1人參與
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CRSPR Cas9技術(shù)做細(xì)菌的基因敲除相關(guān)問(wèn)題請(qǐng)教 本人就讀于中山大學(xué)一年級(jí)博士，做了半年的基因敲除工作。第一次選用的標(biāo)準(zhǔn)菌株自身存在太多種質(zhì)粒，導(dǎo)致電擊質(zhì)粒會(huì)出現(xiàn)一個(gè)細(xì)菌的自身保護(hù)的排斥反應(yīng)，導(dǎo)致質(zhì)粒電不進(jìn)去。第二次選了不含有任何質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)菌株，首先我把pCasAb質(zhì)粒（我叫它第一質(zhì)粒，包含Cas9蛋白基因片段、RecAb重組酶系統(tǒng)基因片段、tac promoter啟動(dòng)子片段，tac promoter啟動(dòng)子調(diào)控RecAb重組酶系統(tǒng)和Cas9蛋白基因的表達(dá)）電轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)菌，然后進(jìn)行抗性篩選和PCR鑒定。篩選轉(zhuǎn)化成功的菌株制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)（添加IPTG以誘導(dǎo)RecAb重組酶和Cas9核酸酶表達(dá)），然后把構(gòu)建好的第二質(zhì)粒pCasAb質(zhì)粒（包含可表達(dá)sgRNA的啟動(dòng)子；spacer：用于插入約20bp的靶點(diǎn)序列；抗性基因片段；sacB基因：用于后續(xù)質(zhì)粒消除的蔗糖敏感基因等）和80bp長(zhǎng)度的修復(fù)模板DNA共同電轉(zhuǎn)進(jìn)上述感受態(tài)。然后涂布于雙抗板上�？次墨I(xiàn)說(shuō)這種方法成功率很高的，最后在雙抗板上長(zhǎng)出的單菌落很多，經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證并沒(méi)有敲除成功，凝膠電泳條帶與野生型一致。我就不知道問(wèn)題出在哪里了，懇請(qǐng)大神們給予指導(dǎo)，不勝感謝。 |
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