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absinbio
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[交流]
抗原修復(fù)很重要，各種干貨快記牢！
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做多了IHC實(shí)驗(yàn)的小伙伴，相信對(duì)于抗原修復(fù)都不陌生，這看似簡(jiǎn)單的一小步，往往會(huì)對(duì)IHC實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生顯著影響。愛(ài)必信作為您身邊的科研百寶箱，秉持著最嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真的態(tài)度，為您總結(jié)了一系列從修復(fù)緩沖液、煮沸裝置到修復(fù)方法，注意事項(xiàng)的小技巧，希望這些小細(xì)節(jié)能完善您的實(shí)驗(yàn)，像愛(ài)必信一直堅(jiān)信的一樣，從小處入手，時(shí)刻陪伴您的科研生活，助力實(shí)驗(yàn)大成功。 抗原修復(fù)是針對(duì)石蠟包埋的切片的必要步驟，大多數(shù)甲醛固定的組織在開(kāi)始染色前都要先修復(fù)抗原，這是由于在固定過(guò)程中產(chǎn)生了亞甲基橋使蛋白之間交聯(lián)屏蔽了抗原位點(diǎn)。常用的兩種方法為熱修復(fù)法（HIER）和酶解法。 一、熱修復(fù)法 1. 熱修復(fù)緩沖液 適用于HIER的緩沖液有多種，我們推薦兩種常用的緩沖液：pH 6.0，10mM檸檬酸鹽緩沖液和pH 8.0，0.5mM EDTA緩沖液。具體使用哪種緩沖液可以參考您的抗體說(shuō)明書(shū)，通常來(lái)講，EDTA緩沖液適合多數(shù)磷酸化酪氨酸特異性抗體，而檸檬酸鹽緩沖液則適用于其他多數(shù)抗體。 abs9133 EDTA, 0.5 M, pH 8.0 abs9147 Sodium Citrate, Dihydrate 2. 熱修復(fù)方法 (1)、高壓蒸汽法 ▲ 將合適的抗原修復(fù)緩沖液加入高壓鍋內(nèi)，然后將鍋置于加熱板并開(kāi)至最大功率，此時(shí)不要把蓋子蓋緊。在等待煮沸過(guò)程中，進(jìn)行脫蠟復(fù)水。 ▲ 煮沸后，將玻片放入高壓鍋，蓋緊蓋子，小心燙傷。 ▲ 高壓鍋達(dá)到最大壓力后，維持3分鐘。 ▲ 3分鐘后，關(guān)掉加熱板，將高壓鍋取下放置。 ▲ 釋放蒸汽，冷水冷卻鍋身。壓力下降后打開(kāi)鍋蓋，冷水冷卻10分鐘。小心燙傷，修復(fù)完畢。 注意事項(xiàng)： ● 3分鐘只是建議時(shí)間，并不是所有抗原的最佳修復(fù)時(shí)間，可以設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)，分別設(shè)定1、2、3、4……分鐘進(jìn)行探索，確定最佳修復(fù)時(shí)間。 ● 確保玻片完全冷卻再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 (2)、微波法 微波法不要使用家用微波爐，沒(méi)有高壓環(huán)境，修復(fù)時(shí)間長(zhǎng)，會(huì)使切片解離。請(qǐng)使用科研專用微波爐。 向微波爐專用容器中加入合適的修復(fù)緩沖液 ▲ 將玻片放入容器，置于微波爐內(nèi)。將溫度設(shè)置在98℃維持20分鐘以修復(fù)抗原 ▲ 20分鐘后，取出容器放置于水中冷卻10分鐘，小心燙傷，修復(fù)完畢。 注意事項(xiàng)： ● 要確保修復(fù)緩沖液足以浸沒(méi)玻片幾厘米，防止煮沸過(guò)程中變干。 ● 20分鐘同樣也是建議修復(fù)時(shí)間，可設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)，自行探究最佳修復(fù)時(shí)間。 ● 確保玻片徹底冷卻。 二、酶解修復(fù)法 可依據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)選擇需要的酶，如果沒(méi)有，胰蛋白酶適用于大多數(shù)福爾馬林/PFA固定后需要修復(fù)的抗原。常使用的酶解修復(fù)方法有滴管法和浸泡法。 abs9118 蛋白酶K abs47047375 胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%) 不含酚紅 (1)、滴管法 ▲ 將胰蛋白酶預(yù)熱至37℃。小心的將組織切片周圍的水吸干，然后吸取酶溶液滴加到切片上（一般50-100ul）。用吸管尖端將酶溶液鋪蓋住整個(gè)切片，注意不要弄壞組織 ▲ 將玻片置于加濕器，然后37℃孵育。避免直接將玻片放入恒溫箱架子上，否則會(huì)因溫度不均影響染色質(zhì)量。▲ 盛放玻片的容器最好先預(yù)熱再放入恒溫箱內(nèi)。 ▲ 10-20分鐘后，取出玻片，流水沖洗3分鐘。修復(fù)完畢。 (2)、浸泡法 將水浴溫度設(shè)置為酶最適宜溫度。向盛放玻片架的兩個(gè)容器中加入超純水。容器放入水浴加熱。 ▲ 將玻片放入水浴箱其中一個(gè)容器加熱 ▲ 用水浴箱中另一個(gè)容器中的熱水制備抗原修復(fù)緩沖液，然后將盛有緩沖液的容器放回水浴箱中重新加熱。 ▲ 將加熱過(guò)的玻片放入酶溶液中10-20分鐘并間歇緩慢震蕩。取出玻片在流水下沖洗3分鐘，將酶漂洗干凈。 注意事項(xiàng)： 有些酶需要特殊緩沖溶液和活性輔助因子。 ● 水或緩沖液體積要足夠沒(méi)過(guò)玻片 ● 若將冷玻片直接放入酶溶液中會(huì)使溶液溫度降低從而酶活性降低，導(dǎo)致抗原位點(diǎn)修復(fù)不徹底。 ● 盡可能快的準(zhǔn)備出抗原修復(fù)緩沖液以避免妨礙酶活性的發(fā)揮。放入玻片之前使溶液達(dá)到需要的溫度。 ● 10-20分鐘只是建議孵育實(shí)驗(yàn)�？勺孕性O(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)探究最佳孵育時(shí)間。 |
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