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凋亡檢測不會做？常用方法大總結(jié)
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細(xì)胞凋亡檢測在生物醫(yī)學(xué)實驗中應(yīng)用廣泛，不僅在多種疾病機(jī)制探究中要用到，更是可能在癌癥治療領(lǐng)域有所突破，今天小編總結(jié)了幾種常見的凋亡檢測方法，來看看有沒有你需要的吧： 一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測 1 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡 （1） 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，全面皺縮，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體，凋亡小體為數(shù)個圓形小體圍繞在細(xì)胞周圍。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落�！ � （2） 染色細(xì)胞： 姬姆薩（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常細(xì)胞核色澤均一；凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)；壞死細(xì)胞染色淺或沒染上顏色。 蘇木素-伊紅（HE）染色：細(xì)胞核固縮碎裂、呈藍(lán)黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細(xì)胞），正常細(xì)胞核呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色，壞死細(xì)胞核呈很淡的藍(lán)色或藍(lán)色消失。 二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡早期，PS可從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。磷脂酰絲氨酸的轉(zhuǎn)位發(fā)生在凋亡早期階段，先于細(xì)胞核的改變、DNA斷裂、細(xì)胞膜起泡。體內(nèi)的吞噬細(xì)胞可通過識別磷脂酰絲氨酸來清除凋亡細(xì)胞。Annexin-V（green）是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合，細(xì)胞處于調(diào)亡或壞死時，Annexin-V可為陽性（早期壞死細(xì)胞可能為陰性），是檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 PI和Annexin-V雙標(biāo)： 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。 *注意：細(xì)胞凋亡時其DNA可染性降低被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞標(biāo)志之一，但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結(jié)構(gòu)的改變使其與染料結(jié)合的能力發(fā)生改變所致。在分析結(jié)果時應(yīng)該注意。 活細(xì)胞不能被Annexin V-FITC或PI染色（右圖左下象限）。早期凋亡細(xì)胞因磷脂酰絲氨酸的暴露及具有完整細(xì)胞膜，故呈Annexin V-FITC染色陽性及PI染色陰性（右圖右下象限）。壞死或晚期凋亡的細(xì)胞呈Annexin V-FITC及PI染色雙陽性（右圖右上象限） *注意：未處理的對照細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)的過程中也有一小部分的細(xì)胞死亡發(fā)生。 三、線粒體膜電位的檢測 線粒體跨膜電位下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。 注意事項 1． 始終保持平衡染液中pH值的一致性，因為pH值的變化將影響膜電位�！ � 2． 與染料達(dá)到平衡的細(xì)胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結(jié)合，降低染料的濃度，引起假去極化。 四、DNA片斷化檢測 細(xì)胞凋亡時主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮, 染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細(xì)胞經(jīng)處理后，采用常規(guī)方法分離提純DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細(xì)胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細(xì)胞量很少，還可在分離提純DNA后，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）使DNA標(biāo)記，然后進(jìn)行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細(xì)胞中DNA ladder的形成。 1.大分子染色體DNA片段的測定 細(xì)胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達(dá)到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細(xì)胞凋亡早期產(chǎn)生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術(shù)可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當(dāng)電場方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能繼續(xù)向前移動。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當(dāng)DNA分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA就可以按其分子量大小分開。 2.DNA Ladder 測定 3.凋亡細(xì)胞DNA含量的流式細(xì)胞計分析 4.ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH) 優(yōu)點(diǎn)：敏感度高，適合于檢測少量樣本，小部分凋亡細(xì)胞。如臨床活組織檢測。 五、 TUNEL法 細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測定，并可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。 愛必信生物也可提供以上多種凋亡檢測試劑: abs50016 線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1) abs50017 線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-10) abs50021 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒-FITC abs50001 Annexin V-FITC apoptosis assay kit abs60009 100bp Ladder DNA Marker |
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