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牛血清白蛋白BSA在WB實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用 已有1人參與
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牛血清白蛋白（BSA）在生化實(shí)驗(yàn)中有廣泛的應(yīng)用, 例如在WB實(shí)驗(yàn)中加入BSA, 通過(guò)提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度，對(duì)酶起保護(hù)作用。防止酶的分解和非特異性吸附，能減輕有些酶的變性，減輕不利環(huán)境因素如加熱，表面張力及化學(xué)因素引起的變性的。具體的WB實(shí)驗(yàn)操作和BSA在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用愛(ài)必信分享如下： 一．蛋白質(zhì)的樣品制備： 取心肌組織50mg，待組織塊自行溶解，用濾紙吸去其表面水分，將組織塊放入玻璃勻漿器球狀部位，用組織剪盡量將其剪碎，將剪碎的心肌組織放入玻璃勻漿器的桿狀部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌組織的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），將玻璃勻漿器插入冰中，勻漿約30分鐘。 將心肌組織勻漿轉(zhuǎn)移到離心管中，4℃12000g離心5分鐘，收集上清（如有粘稠物進(jìn)一步用超聲處理），樣品分裝凍存于-20℃?zhèn)溆谩?br /> 二 .測(cè)定蛋白濃度： 1． 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白標(biāo)準(zhǔn)）+90ulPBS液稀釋成0.5mg/ml的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。 2.3 分別以0、1、2、4、8、12、16、20ul將蛋白標(biāo)準(zhǔn)液加入96孔板的第1~8標(biāo)準(zhǔn)孔中，在其他樣品孔中加入10ul待測(cè)樣品。 2.4 分別加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室溫放置2小時(shí)。 2.6 用酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度：測(cè)定A562，依標(biāo)準(zhǔn)曲線算出蛋白濃度。 三． SDS-PAGE電泳： 3.1 制 膠: 按比例配制分離膠，緩緩地?fù)u動(dòng)溶液，使激活劑混合均勻，將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中，再在液面上小心注入一層水，以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液中，靜置40min。同前按比例配制濃縮膠，但混勻溶液時(shí)不要過(guò)于劇烈以免引入過(guò)多地氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分，連續(xù)平穩(wěn)的注入凝膠溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡，靜制60min以上以保證完全聚合。 3.2 預(yù)電泳： 將聚合好的凝膠安置于電泳槽中，小心拔去梳子，加入電泳緩沖液后低電壓10-20V的預(yù)電泳20-30min。（目的是清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)， 疏通凝膠孔徑以保證電泳過(guò)程中電泳的暢通）。 3.3 樣品準(zhǔn)備：首先計(jì)算上樣體積，然后按樣品：上樣buffer=4：1的比例加入上樣bufer混勻，沸水煮10分鐘，冰上5分鐘。 3.4 加 樣： 預(yù)電泳后依次加入標(biāo)準(zhǔn)品（Marker）和待分析樣品。（加樣時(shí)間要盡量短，以免樣品擴(kuò)散，可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應(yīng)。每個(gè)泳道加5ul 。 3.5 電 泳： 加樣完畢，選擇80V恒壓進(jìn)行電泳，電泳直至溴酚藍(lán)染料前沿到達(dá)兩膠交界處（一般約20分鐘），更換至100V恒壓電泳，電泳直至溴酚藍(lán)染料前沿下至凝膠末端處，即停止電泳（一般約為1小時(shí)20分鐘）。 四．轉(zhuǎn) 膜： 4.1 切膠：將電泳完畢的膠完整的放在盛有電轉(zhuǎn)液的玻璃皿中，將目的蛋白所在區(qū)域切下來(lái)，測(cè)量其長(zhǎng)寬，并記錄。 4.2 剪膜和濾紙：按膠的尺寸剪膜和濾紙（濾紙長(zhǎng)寬較凝膠小0.5~1mm，PVDF膜長(zhǎng)寬較凝膠大0.5~1mm），濾紙浸入盛有電轉(zhuǎn)液的玻璃皿中10秒鐘，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒鐘，然后將兩者都放入盛有去離子水的玻璃皿中3分鐘，進(jìn)一步放入盛有電轉(zhuǎn)液的玻璃皿中3分鐘。 4.3 向電轉(zhuǎn)槽中倒入部分電轉(zhuǎn)液，將海綿浸入。按如下順序制作“三明治”（注意避免兩邊濾紙相互接觸，以免發(fā)生短路）。從正極到負(fù)極按如下順序排列：正極-海綿-雙層濾紙-PVDF膜-凝膠-雙層濾紙-海綿-負(fù)極。（其中不能留有氣泡）卡緊轉(zhuǎn)膜板，電轉(zhuǎn)槽中倒?jié)M電轉(zhuǎn)液，將轉(zhuǎn)膜板浸入電轉(zhuǎn)槽中，注意正負(fù)極要正確。插上電源，設(shè)定恒流20mA轉(zhuǎn)膜，4℃冰箱中過(guò)夜。 五、膜的封閉: 用TBST液洗滌印跡膜10分鐘x2次。放入5%BSA（abs49001012）封閉液內(nèi)，搖床震動(dòng)，70轉(zhuǎn)/分鐘，室溫封閉1小時(shí)30分鐘。 六、一抗孵育： 6.1 配制一抗：按相應(yīng)抗體的效價(jià)加入一抗稀釋液，一抗稀釋液按0.05% TBST（ml）： BSA（g）=20：1配制。 6.2一抗孵育：將封閉后的膜放入雜交袋中，加入一抗約1ml，室溫?fù)u床（70轉(zhuǎn)/分鐘）孵育1小時(shí)30分鐘。 6.3 用TBST洗滌膜10分鐘x3次。 七、二抗孵育： 7.1 配制二抗：按相應(yīng)抗體的效價(jià)加入二抗稀釋液，二抗稀釋液按0.05%TBST（ml）： BSA（g）=20：1配制。 7.2 二抗孵育：將一抗孵育后的膜放入二抗中，室溫?fù)u床（70轉(zhuǎn)/分鐘）孵育1小時(shí)30分鐘。 7.3 用TBST洗滌膜10分鐘x3次。 八、ECL顯色 8.1 配制ECL工作液：在避光的容器中按A液：B液=1：1的比例配制。 8.2 按膜：工作液=10cm2：1ml的比例將ECL工作液覆蓋到膜表面，放置1~2分鐘后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照。 |
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