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absinbio
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wb實(shí)驗(yàn)常見診斷報告和優(yōu)化方案 已有1人參與
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實(shí)驗(yàn)案例1：泳道高背景 問題分析：多條帶以及高背景集中在泳道上，大概率是樣本時間太久，或者蛋白酶抑制劑沒加發(fā)生了蛋白降解，或者是組織樣本中，成分太復(fù)雜，加上抗體特異性一般造成的。 問題診斷 1. 樣本時間太久 2. 組織樣本背景高 3. 蛋白酶抑制劑/磷酸酶抑制劑沒有加 建議方案 新鮮制備樣本，加入蛋白酶抑制劑。對于組織樣本，要求超聲。對于特異性一般的抗體，先用細(xì)胞樣本做下。 實(shí)驗(yàn)案例2：全膜高背景 問題分析：像這種全膜的高背景，大概率是緩沖液的問題�？梢蕴岣叻忾]液濃度和封閉時間，抗體稀釋液使用5%脫脂牛奶或者根據(jù)說明書要求來，洗滌的TBST增加nacl濃度以及吐溫濃度，增加洗滌的次數(shù)和時間。 問題診斷 1. 封閉液 2. 抗體稀釋液 3. 洗滌 建議方案 封閉液使用5%脫脂牛奶（新鮮配置），4度封閉過夜�？贵w稀釋液使用5%脫脂牛奶，TBST中nacl濃度增加至500mM，吐溫增加至0.5%，洗滌15min*3次或者10min*4次。 PS：這個case客戶本來使用1%BSA稀釋抗體，換用5%BSA，背景就沒問題了 實(shí)驗(yàn)案例3：全膜高背景 問題分析：排除二抗非特異性，就是不加一抗，直接加二抗孵育，看是否有非特異性條帶，對于一般客戶來說，更換二抗是更加簡便的方法。（能拿結(jié)果，不僅僅驗(yàn)證），二抗稀釋液強(qiáng)烈推薦5%脫脂牛奶，如果前兩者都無法改善結(jié)果，考慮一抗非特異性。 問題診斷 1. 二抗非特異性 2. 抗體稀釋液 3. 一抗非特異性 建議方案 更換二抗，排除二抗非特異西，二抗稀釋液使用5%脫脂牛奶，更換一抗。 更換二抗后【如左圖】 實(shí)驗(yàn)案例4：高背景、雜帶 問題分析：全膜的背景問題，主要是一抗二抗未洗滌干凈，基本殘留在膜上。 問題診斷 1. 洗滌不充分 建議方案 TBST中nacl濃度增加至500mM，吐溫增加至0.5%，洗滌15min*3次或者10min*4次 優(yōu)化后結(jié)果【如左圖】 實(shí)驗(yàn)案例5：條帶過粗、雜帶 問題分析：條帶過于粗往往是因?yàn)闃颖旧蠘恿刻�，一抗�(jié)舛雀�，加上曝光時間久。 問題診斷 1. 樣本信號太強(qiáng) 2. 雜帶多 3. 曝光時間太久 建議方案 減少上樣量，減少一抗?jié)舛�，減少曝光時間。 優(yōu)化后結(jié)果【如左圖】 實(shí)驗(yàn)案例6：不出帶 問題分析：一般沒條帶的主要關(guān)注樣本表達(dá)量，文獻(xiàn)或者看上下游蛋白結(jié)果，如果是磷酸化的，還要看上下游的磷酸化。對于大分子量（150KD以上）或者小分子蛋白（小于20KD），看下麗春紅染色，確認(rèn)轉(zhuǎn)膜效率。抗體濃度和曝光時間幫助增強(qiáng)信號。 問題診斷 1. 樣本表達(dá)量和處理方式 2. 轉(zhuǎn)膜 3. 抗體濃度 4. 曝光時間 建議方案 增加上樣量，使用合適的刺激處理方式，增加陽性 |
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2樓2020-08-14 08:42:04
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