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免疫印跡(wb實(shí)驗(yàn))常見問題解答 已有2人參與
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1）如果沒有注明可以用來做Western blot的一抗，可以用于Western blot實(shí)驗(yàn)嗎？ 這個(gè)要看情況的，因?yàn)橛械目贵w是識(shí)別線性表位的,有的是識(shí)別構(gòu)象型表位的，識(shí)別構(gòu)象型表位的抗體不能用于Western blotting實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樵赪estern blotting中抗體識(shí)別的是完全變性的蛋白質(zhì)抗原，而蛋白質(zhì)抗原的構(gòu)象型表位變性時(shí)被破壞。 2）做wb實(shí)驗(yàn)每次只加一種一抗，可以同時(shí)加兩種或者多種一抗的嗎？ 最好還是不要同時(shí)加兩種及兩種以上一抗。因?yàn)槿绻Y(jié)果里面有非特異信號(hào)的話，就說不清楚了。做免疫印跡實(shí)驗(yàn)中在同一張膜上檢測(cè)目的蛋白和內(nèi)對(duì)照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL發(fā)光檢測(cè)、壓片、洗片；漂洗以后，再上內(nèi)對(duì)照的一抗、二抗，ECL發(fā)光檢測(cè)、壓片、洗片。 3）wb實(shí)驗(yàn)中用一抗,單抗好些還是用二抗及多抗好些？用于Western blot的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求？ 作為Western blot來講，理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少一般價(jià)格偏高，愛必信的一抗，種類比較全，價(jià)格也比較合理。用于wb實(shí)驗(yàn)的抗體和用于ELISA實(shí)驗(yàn)的抗體，一般來說用于Western blot 實(shí)驗(yàn)的抗體識(shí)別的是氨基酸序列特異性；而可用于ELISA實(shí)驗(yàn)的抗體則要看抗原種類，有些是識(shí)別氨基酸序列特異性，有些是識(shí)別構(gòu)像特異性。所以一般根據(jù)抗體說明書來確定。 做免疫印跡實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇抗體主要應(yīng)考慮兩個(gè)問題，一是所選抗體是否能識(shí)別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一個(gè)是所選抗體是否會(huì)引起交叉反應(yīng)條帶。 4）結(jié)合ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)之后顯影發(fā)現(xiàn)膠片上的條帶是空心的，而且熒光很快就沒了？ 一種情況是POD濃度高ECL很快被淬滅掉，導(dǎo)致蛋白豐度越高的地方反而沒帶，邊緣地帶反而有顯色。 5）要做磷酸化某因子Western blot實(shí)驗(yàn)，其二抗有何要求？ 這個(gè)對(duì)二抗無要求，要看你實(shí)驗(yàn)條件來選擇，一般推薦用HRP標(biāo)記的二抗，愛必信二抗的質(zhì)量過硬，價(jià)格公道且種類比較全，建議愛必信網(wǎng)站查一下。 6）WB實(shí)驗(yàn)使用的膜哪種最好啊，PVDF好還是NC膜，兩者如何選擇？ PVDF膜價(jià)格相對(duì)NC較貴，但可重復(fù)使用，特別適合蛋白印跡，結(jié)合能力較強(qiáng)。 NC膜價(jià)格比較便宜，應(yīng)用較廣，結(jié)合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復(fù)使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。具體使用還要參考相關(guān)實(shí)驗(yàn)需求。 7）半干轉(zhuǎn)膜是否要求膜，濾紙，膠同樣大��？因?yàn)槟z大小不一定規(guī)則，膜和濾紙會(huì)大一點(diǎn)，那樣會(huì)不會(huì)短路？什么是短路？如何控制和發(fā)現(xiàn)短路呢？ 可以相等，但是如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層慮紙也不能因過大而相互接觸，這樣同樣會(huì)短路，電流不會(huì)通過膠和慮紙。轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的， 最后結(jié)束時(shí)一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對(duì)就不會(huì)短路。 8）Western blot實(shí)驗(yàn)?zāi)姆N染色好？ ● 陰離子染料是較常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測(cè)極限可達(dá)到1.5μg，考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測(cè)后容易從蛋白質(zhì)中除去 ，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。缺點(diǎn)是：溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語(yǔ)正電賀的膜。靈敏度低。 ● 膠體金，靈敏度高，檢測(cè)范圍可到pg級(jí)，但染色比穩(wěn)定。 ● 生物素化靈敏度位于1、2之間，可用于任何一種膜。 9）wb實(shí)驗(yàn)中，如果不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？ 可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（是指終濃度）(優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考《愛必信實(shí)驗(yàn)指南之Western blot手冊(cè)》)，因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至6％。太大時(shí)還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時(shí)間 10）蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)時(shí)，PVDF膜重復(fù)利用幾次？ 重復(fù)利用指的是可以在顯影定影完成以后重新洗脫（stripping buffer）然后重新封閉，一抗（可以是不同的，前提是目的蛋白在pvdf膜上），二抗孵育，顯影定影。重復(fù)利用的情況還要看實(shí)驗(yàn)?zāi)愕牡鞍棕S度 ，每一次stripping都會(huì)洗掉蛋白，同時(shí)有些抗體結(jié)合緊的也洗不完全，所以要看根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況而定。 |
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