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absinbio
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只會(huì)半定量分析？來看WB的靈活運(yùn)用吧 已有1人參與
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WB實(shí)驗(yàn)是我們平時(shí)最常接觸到的實(shí)驗(yàn)類型，也是最經(jīng)典的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，每年寫WB實(shí)驗(yàn)技巧的文章，真是讓人看花了眼，如果你厭倦了老生常談的實(shí)驗(yàn)技巧，不如來看看我們今天的拓展，WB在半定量分析之外的妙用吧。 一、目標(biāo)蛋白構(gòu)象結(jié)合功能分析 WB 用于構(gòu)象分析，主要基于其不同構(gòu)象形式時(shí)分子量所發(fā)生的變化，比如不同的寡聚、翻譯后修飾、配體結(jié)合等情況。還原和非還原型電泳分析鏈間二硫鍵，并判斷蛋白聚合情況； 抗體表位分析法初步判斷蛋白空間結(jié)構(gòu)；利用（N - 端或 C - 端）抗體研究蛋白異構(gòu)體及翻譯后酶切修飾；更重要的是，WB 等方法獲得的是蛋白在寡聚、結(jié)合配體、底物、信號(hào)標(biāo)簽等生理?xiàng)l件下，其分子量的動(dòng)態(tài)變化，從而將蛋白結(jié)構(gòu)研究與功能研究有機(jī)結(jié)合。 泛素化-蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)于錯(cuò)誤蛋白降解具有重要意義。上圖顯示 Nrf2 蛋白在泛素連接酶作用時(shí)間延長(zhǎng)后，泛素化程度逐漸增加。若將各時(shí)間點(diǎn)的 Nrf2 蛋白結(jié)構(gòu)解析，即可將該蛋白的結(jié)構(gòu)研究與功能研究相結(jié)合。在 Virology 的這篇文獻(xiàn)中，作者發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑 MG132 和 lactacystin 可顯著降低豬 II 型圓環(huán)病毒（PCV2）早期感染的滴度，并通過對(duì)泛素基因的沉默實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其也顯著降低 PCV2 滴度，由此推斷泛素 - 蛋白酶體系統(tǒng)是 PCV2 的早期復(fù)制所必須的。 二、磷酸化信號(hào)分析 磷酸化是細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)方式，特異的磷酸化抗體可以用于：分析信號(hào)分子磷酸化水平，從而與其功能研究建立聯(lián)系；分析不同磷酸化位點(diǎn)對(duì)于信號(hào)分子功能的影響，比如 p53 總磷酸化水平與不同位點(diǎn)磷酸化水平對(duì)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，以及與癌癥發(fā)生發(fā)展之間的聯(lián)系。 Cai 等在JBC上發(fā)表的文章，揭示了微小RNA在腫瘤發(fā)生中的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)微小RNA miR-17/20a 靶向抑制 p53 的核心激酶DAPK3（死亡相關(guān)蛋白激酶 3）的表達(dá)，去除這些微小 RNA 將導(dǎo)致依賴于 p53 的微小RNA轉(zhuǎn)錄抑制被去除，從而形成一個(gè)正反饋環(huán)，促進(jìn)腫瘤形成，它們被稱為原癌微小 RNA（oncomiRs）。C圖清楚顯示了當(dāng)對(duì) Hela 細(xì)胞轉(zhuǎn)入 miR-17、miR-20a 或 miR-17/20a 拮抗劑后，DAPK3 蛋白表達(dá)增加，雙鏈 DNA 不穩(wěn)定性的標(biāo)志物 ATM（Ser-1981）、p53BP1（Ser-25/29）蛋白絲氨酸磷酸化程度增高，而各自總蛋白水平并沒有變化。D 圖進(jìn)一步確認(rèn)了這些磷酸化水平升高是由 DAPK3 表達(dá)量升高引起的。p53 磷酸化水平升高將導(dǎo)致其抑制原癌微小 RNA 轉(zhuǎn)錄的水平下降，進(jìn)一步提高 DAPK3 激酶的表達(dá)。該研究補(bǔ)充了原有的通過 E2F 家族蛋白激活 miR-17/20a 的負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路。 |
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