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absinbio
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WB結(jié)果圖有問(wèn)題？有時(shí)候還真不能怪抗體 已有1人參與
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同學(xué)們做WB首先要了解你需要的蛋白mark，通常可分為： 1、未預(yù)染的Marker即寬分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)、高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)以及低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn); 2、染的Marker即單色預(yù)染和多色預(yù)染。 在western Blot過(guò)程中，分子量Marker往往對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著不可忽視的作用。這個(gè)Western Blot參照家族的一員的作用主要是用來(lái)指示蛋白條帶所對(duì)應(yīng)的分子量大小，只有標(biāo)準(zhǔn)量精確無(wú)誤了，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才有說(shuō)服力，除此之外，蛋白標(biāo)準(zhǔn)還有表示轉(zhuǎn)移成功或者蛋白在凝膠上的電泳程度等等的作用，所以選擇正確的蛋白Marker也是western blot實(shí)驗(yàn)成功的必要條件之一。 一. 未染色(premixed)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) 由于沒(méi)有附帶染料分子或者是標(biāo)記分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，所以未染色的蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)是最簡(jiǎn)單，也是最準(zhǔn)確的一種�，F(xiàn)在的marker多數(shù)都選用預(yù)混和的Marker，方便不同大小的蛋白比較。預(yù)混的Marker通常有幾條帶加倍濃度作為指示，因?yàn)榛旌系臈l帶越多，不好辨識(shí)。所以當(dāng)看到特別濃的那幾條標(biāo)志帶就記得是哪里了。不過(guò)要記得，小帶通常都不那么容易看清楚的。在選擇上來(lái)說(shuō)，當(dāng)然是選擇其中至少有一條條帶和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。如果你的蛋白不幸在兩條跨度較大Marker條帶之間，則需選取適當(dāng)跨度mark。預(yù)混的Marker使用上不如預(yù)染Marker，因?yàn)殡娪具^(guò)程中完全看不到，必須要結(jié)合目標(biāo)蛋白方可使用，無(wú)法對(duì)實(shí)驗(yàn)起參照作用。 二.預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)染蛋白分子量是一些純化好的蛋白混合物，通過(guò)與染料共價(jià)耦聯(lián)，在電泳過(guò)程中或者轉(zhuǎn)膜時(shí)可以直接觀察到。預(yù)染蛋白分子量的出現(xiàn)方便了我們的實(shí)驗(yàn)，這種蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)可以幫助我們?cè)陔娪緯r(shí)、電泳后，以及轉(zhuǎn)膜后監(jiān)測(cè)電泳情況和估計(jì)遷移率——比如，已知垂直電泳最佳分辨區(qū)域大約在膠的2/3處，如果使用預(yù)染Marker就可以預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白進(jìn)入最佳分辨區(qū)時(shí)停止電泳以得到最佳分辨效果;如果觀察到Marker電泳異常也可以及時(shí)終止電泳;另外在Western Blot轉(zhuǎn)膜以后可以直接觀察蛋白轉(zhuǎn)膜是否完全，還可以在膜上標(biāo)記蛋白分子量，所以吸引了許多實(shí)驗(yàn)室人員購(gòu)買預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)。值得注意的是預(yù)染蛋白Marker與染料共價(jià)耦聯(lián)，所以在不同的緩沖條件下電泳時(shí)遷移特性可能會(huì)發(fā)生某些變化，可能導(dǎo)致一些偏差，所以不太適合精確定位蛋白——不過(guò)多數(shù)情況下Marker的條帶未必能和我們的目標(biāo)蛋白完全一樣，我們得到的也不過(guò)是一種相對(duì)Marker指示的參考大小，最后都需要Western來(lái)定性，所以如果不是要區(qū)分大小相近的條帶，預(yù)染Marker還是很好用的，而且也可以和未染色的蛋白標(biāo)準(zhǔn)一起使用。 預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)可以分為兩種：?jiǎn)紊A(yù)染和多色預(yù)染，其實(shí)區(qū)別就在于幫助在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中辨認(rèn)某個(gè)條帶的大小——Marker條帶越多參考價(jià)值越大，可就越難辨認(rèn)區(qū)分，如果用不同的顏色來(lái)區(qū)別就比較好辨認(rèn)。如果沉悶的電泳實(shí)驗(yàn)中跑出五顏六色的彩虹Marker，單色的Marker通常是利用其中某些條帶加倍濃度來(lái)提示其大小的。還有一點(diǎn)特別要注意，由于轉(zhuǎn)膜是一個(gè)將膠里的Marker濃縮在透明膜上，所以需要的上樣量相對(duì)少一些，如果想要在電泳過(guò)程中看到美麗的“彩虹”，或者單色的Marker往往需要比說(shuō)明書(shū)里多加一些Marker的。 |
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