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Anthony07新蟲(chóng) (初入文壇)
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[求助]
【求助/交流】假單胞菌RED重組系統(tǒng)最后檢驗(yàn)PCR沒(méi)有條帶
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 本人用RED重組系統(tǒng)敲除來(lái)敲除假單胞菌的某一基因，之前一直都能P出置換過(guò)的抗性條帶，自從疫情后，再次驗(yàn)證完全P不出條帶了。我重新開(kāi)始制備，我的具體步驟是用pcm130擴(kuò)增出的抗四環(huán)素基因（上下游添加20bp的同源臂，之前是35bp，但是Tm值太大，縮減成20bp，之前也成功擴(kuò)出來(lái)了。），然后電轉(zhuǎn)化到帶有Pkd46的假單胞菌感受態(tài)（制備感受態(tài)前大搖用了L-阿拉伯糖誘導(dǎo)過(guò)，制備感受態(tài)用的是10%的甘油多次離心，全程4度制備），10ul的目的片段+100ul的感受態(tài)混勻冰浴30min后電轉(zhuǎn)，然后在加有氨芐和四環(huán)素的抗性LB平板上涂布（也加了L-阿拉伯糖）然后 隔夜培養(yǎng)也長(zhǎng)出了密密麻麻的單菌落，然后擴(kuò)大培養(yǎng)也能搖起來(lái)，然后做菌液PCR擴(kuò)增四環(huán)素抗性條帶（也提過(guò)基因組DNA去P，cDNA也試過(guò)），試過(guò)多次，只有引物二聚體，很懵逼，不知道哪里出錯(cuò)了。有木有大神給點(diǎn)建議，該如何整。都能在雙抗性的平板上長(zhǎng)出單菌落，卻沒(méi)辦法P出條帶，然后拿這個(gè)菌也擴(kuò)增不出16s，有考慮過(guò)是不是真菌污染，擴(kuò)增過(guò)18s，沒(méi)條帶，確認(rèn)沒(méi)有污染。請(qǐng)求大神幫忙，感激不盡！ |
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slcat
新蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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按理說(shuō)不應(yīng)該擴(kuò)增不出16 S，有沒(méi)有考慮過(guò)是PCR的問(wèn)題？找個(gè)實(shí)驗(yàn)室的其他人幫你做一遍，PCR的材料都用他自己的 發(fā)自小木蟲(chóng)Android客戶(hù)端 |
2樓2020-06-08 22:31:34
Anthony07
新蟲(chóng) (初入文壇)
- 應(yīng)助: 0 (幼兒園)
- 金幣: 130.6
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3樓2020-06-08 22:35:08
4樓2020-06-08 23:50:40
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