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艾柏森生物

鐵蟲 (小有名氣)

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[交流] western blot實(shí)驗(yàn)步驟詳解

一、實(shí)驗(yàn)步驟：
1、細(xì)胞總蛋白提取
1.1 對于懸浮細(xì)胞: 離心收集細(xì)胞，每106細(xì)胞加250 ul RIPA（在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑），振蕩。如果需要提高蛋白濃度，可以適當(dāng)減少細(xì)胞總蛋白提取試劑體積。
1.2 對于貼壁細(xì)胞:
1.2.1 用TBS沖洗細(xì)胞2-3次。最后一次徹底吸干殘留液。
1.2.2 加入適當(dāng)體積的 RIPA（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）于培養(yǎng)板、瓶內(nèi)3-5min。期間反復(fù)晃動培養(yǎng)板、瓶，使試劑與細(xì)胞充分接觸。
1.2.3 用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下，收集到1.5ml離心管中。
1.3 冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。
1.4 12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。
2、組織蛋白提取：
2.1 組織塊用冷TBS洗滌2-3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）冰上徹底勻漿。如果需要提高蛋白濃度，可以適量減少該試劑體積。
2.2 將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，振蕩。冰浴30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。
2.3 12000g離心5min，收集上清，即為總蛋白溶液。
3、蛋白濃度測定：BCA法側(cè)蛋白濃度
4、 SDS-PAGE電泳
4.1 清洗玻璃板
4.2 灌膠與上樣
4.2.1 將玻璃板對齊后放入夾中卡緊，操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。
4.2.2 按實(shí)驗(yàn)安排配制分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。大約45min后可倒去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干。
分離膠配比
分離膠濃度
試劑 8% 10% 12% 15% 18% 20% 8% 10% 12% 15% 18% 20%
H2O ml 4.63 4 3.3 2.3 1.3 0.63 6.9 5.9 4.9 3.4 1.9 0.9
30％丙烯酰胺（29：1） ml 2.67 3.3 4 5 6 6.67 4 5 6 7.5 9 10
1.5M TRIS－Hcl(PH 8.8) ml 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8 3.8
10％SDS ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15
AP ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15
TEMED ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul 7.5ul
總體積 ml 10ml 15ml
5%濃縮膠配比
試劑濃度 5%
H2O ml 2 3 4 6
30％丙烯酰胺（29：1）ml 0.5 0.75 1 1.5
1M TRIS－Hcl(PH 6.8)ml 0.5 0.75 1 1.5
10％SDS ul 40 60 80 120
AP ul 30 45 60 90
TEMED ul 4ul 6ul 8ul 12ul
總體積 ml 3ml 4.5ml 6ml 9ml

4.2.3 按前面方法配5%的濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。
4.3 加足夠的電泳液后上樣電泳。將樣品加入電泳孔中，電泳。濃縮膠電壓75V，分離膠用120V。電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
5 轉(zhuǎn)膜（小于20kd的蛋白請使用0.22um的PVDF膜。）
5.1 準(zhǔn)備6張7×225px的濾紙和一張大小適中的 PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。
5.2 在加有轉(zhuǎn)移液的盆里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子，兩塊海綿墊，一支玻棒，濾紙和經(jīng)過活化的PVDF膜。
5.3 將夾子打開使黑的一面保持水平。在墊子上墊海綿、三層濾紙。
5.4 小心剝下分離膠蓋于濾紙上，將膜蓋于膠上，并除氣泡。在膜上蓋三張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊。
5.5 轉(zhuǎn)膜條件（濕轉(zhuǎn)）
5.5.1 快轉(zhuǎn)。300mA恒流轉(zhuǎn)膜半小時，或者200mA轉(zhuǎn)膜1小時，時間可以略微調(diào)整，時間對應(yīng)調(diào)整。
5.5.2 慢轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜過夜，25V恒壓轉(zhuǎn)膜過夜。
6 免疫反應(yīng)
6.1 將轉(zhuǎn)好的膜于室溫下脫色搖床上用5%的脫脂牛奶(0.5%TBST配)，封閉1h。
6.2 稀釋一抗（TBST溶解的5%脫脂牛奶，磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA），4℃孵育過夜（快轉(zhuǎn)），或者4℃孵育抗體3小時（慢轉(zhuǎn)）。
6.3 用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min
6.4 將二抗用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min
7 化學(xué)發(fā)光將ECLA和ECLB兩種試劑在離心管中等體積混合，將PVDF膜的蛋白面朝上與此混合液充分接觸，1-2min后，去盡殘液，包好，放入暗匣中曝光。最后用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影。根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件。
8 凝膠圖像分析將膠片進(jìn)行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

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1樓 2020-05-23 13:11:11

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姑蘇.

新蟲 (初入文壇)

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艾柏森生物(金幣+1): 謝謝參與

我想請教一下關(guān)于內(nèi)參的問題。內(nèi)參是可以直接在生物公司購買嗎？選擇的時候有什么要注意的嗎，跑膠的時候是直接和目的蛋白質(zhì)一起還是有什么別的方法呢？

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8樓2020-06-09 12:28:11

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hjg200802212

禁蟲 (小有名氣)

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4樓2020-05-27 16:59:38

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wlt728

鐵桿木蟲 (著名寫手)

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引用回帖:

8樓: Originally posted by 姑蘇. at 2020-06-09 12:28:11
我想請教一下關(guān)于內(nèi)參的問題。內(nèi)參是可以直接在生物公司購買嗎？選擇的時候有什么要注意的嗎，跑膠的時候是直接和目的蛋白質(zhì)一起還是有什么別的方法呢？

細(xì)胞中有內(nèi)參蛋白的表達(dá)，不需要買，但是做WB時，需要把內(nèi)參蛋白也做了。

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11樓2020-07-29 19:41:05

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p1w9

新蟲 (正式寫手)

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大佬，固體樣本配置勻漿液的配比是多少？

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12樓2020-11-06 22:24:00

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tzynew2樓

2020-05-23 13:50 回復(fù)

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倒二B9樓

2020-07-28 16:58 回復(fù)

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0219215110樓

2020-07-29 07:15 回復(fù)

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