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remax520鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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【代謝組學(xué)技術(shù)】應(yīng)用于代謝組學(xué)中的技術(shù)及化學(xué)計(jì)量方法 已有1人參與
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主要內(nèi)容： 1. 應(yīng)用于代謝組學(xué)中的技術(shù)概述 2. 核磁共振波譜法（NMR） 3. 質(zhì)譜（MS） 4. 液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS） 5. 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS） 6. 毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜（CE-MS） 7. 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的化學(xué)計(jì)量方法 1. 應(yīng)用于代謝組學(xué)中的技術(shù)概述 1.1 如何獲得有效、可靠的代謝組學(xué)數(shù)據(jù) 選用高靈敏度和高選擇性以及能夠檢測(cè)大多數(shù)代謝物的技術(shù)； 在給定的生物樣品中，能夠提供高度可重復(fù)性且低成本。 目前沒(méi)有一種分析工具具備上述所有特征，但目前應(yīng)用最廣泛的代謝組學(xué)方法：核磁共振波譜（NMR）和質(zhì)譜（MS）與氣相色譜（GC）、液相色譜、（LC）或毛細(xì)管電泳（CE）聯(lián)用。 然而，這些分析平臺(tái)都不能單獨(dú)提供生物樣品中整個(gè)代謝組的全面鑒定和量化，因?yàn)槊糠N不同技術(shù)都有一系列優(yōu)缺點(diǎn)。 1.2 非靶向代謝譜分析 核磁共振波譜（NMR）應(yīng)用于代謝組學(xué)，采用的是非靶向的方法，關(guān)注的是整體全局的代謝情況。 非靶向代謝譜分析目的：通常用于鑒定和相對(duì)量化代謝物，這些代謝物依據(jù)分類，具有不同的功能。 這種方法通常與生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)、診斷和與疾病病理生理學(xué)相關(guān)假說(shuō)的產(chǎn)生有關(guān)。Ø優(yōu)點(diǎn)：不必事先知道給定生物樣品的代謝物種類； 缺點(diǎn)：只對(duì)代謝物進(jìn)行半定量，沒(méi)有適當(dāng)注釋下，就識(shí)別出顯著的峰，使深層機(jī)理和生化的理解復(fù)雜化。 代謝物注釋是確定代謝物結(jié)構(gòu)和功能的過(guò)程，代謝物識(shí)別能力的局限性一直是代謝物組學(xué)研究的主要障礙之一。 1.3 靶向代謝譜分析 質(zhì)譜（MS）常被用于靶向代謝組學(xué)研究，重點(diǎn)是精確定量和鑒定一組特定的已知代謝產(chǎn)物。 靶向代謝譜分析的目的：確定并對(duì)感興趣的代謝物進(jìn)行絕對(duì)定量分析，這是通過(guò)光譜匹配到真實(shí)的參考化合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的，該參考化合物通常作為同位素標(biāo)記化合物加入或用作標(biāo)準(zhǔn)曲線生成的額外標(biāo)準(zhǔn)物。 通常與食品或藥物管理引起的特定代謝物和途徑的變化相關(guān)，是藥物開(kāi)發(fā)和毒理學(xué)中的重要分析工具。 缺點(diǎn)：代謝譜僅限于已知的標(biāo)準(zhǔn)代謝物，用這種方法不適合識(shí)別新代謝物。 2. 核磁共振波譜（NMR） 2.1 核磁共振波譜的概述 核磁共振波譜：通過(guò)測(cè)量振蕩射頻電磁場(chǎng)與沉浸在強(qiáng)外磁場(chǎng)中的原子核的相互作用來(lái)研究分子結(jié)構(gòu)。 有些原子核具有所謂的核自旋值，這使得這些原子核能夠產(chǎn)生核磁矩，因?yàn)樗鼈冊(cè)谕獠看艌?chǎng)中的行為就像旋轉(zhuǎn)的磁鐵棒。這些原子核相對(duì)于外場(chǎng)可以有不同的方向，每個(gè)方向都與一個(gè)特定的能級(jí)有關(guān)。所以，當(dāng)一個(gè)質(zhì)子被放置在一個(gè)外部磁場(chǎng)中，質(zhì)子的磁矩分裂產(chǎn)生兩個(gè)能級(jí)：一個(gè)高能級(jí)和一個(gè)低能級(jí)。然而，在核磁共振實(shí)驗(yàn)中，涉及到許多原子核，在平衡狀態(tài)下，一組自旋態(tài)將在高能和低能態(tài)之間產(chǎn)生足以產(chǎn)生凈磁場(chǎng)的能量差。施加電磁能的短脈沖可以誘導(dǎo)能級(jí)之間的躍遷，這一過(guò)程有助于原子核吸收能量，隨后能量被釋放為離散量子，并在核磁共振譜中記錄為峰值。 每一個(gè)峰的位置是通過(guò)相對(duì)于添加的參比化合物（通常是3-三甲基硅基丙酸鹽（TSP））的化學(xué)位移（ppm）來(lái)確定的。根據(jù)化學(xué)位移（在波譜中的位置）和峰值強(qiáng)度，可以確定相對(duì)水平和生化物質(zhì)。此外，如果加入已知濃度的內(nèi)標(biāo)物，則可獲得絕對(duì)濃度。 2.2 1HNMR（氫譜） 1HNMR譜具有很小的化學(xué)位移范圍（通常為0-10ppm），由于生物化學(xué)物質(zhì)的復(fù)雜行和混合程度，峰的分離程度不高，峰值嚴(yán)重重疊（如，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和低分子量代謝物），使得譜的比對(duì)成為一項(xiàng)艱巨任務(wù)。 譜峰重疊問(wèn)題的克服：二維（2D） 1H NMR譜增加了信號(hào)的離散度，闡明了信號(hào)的連接性，從而有助于代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)解釋和鑒定。 常用的2DNMR：J-resolved核磁共振譜；擴(kuò)散有序譜（DOSY）；同核穿透相關(guān)法相關(guān)光譜（COSY）；全相關(guān)譜（TOCSY）;異核鍵相關(guān)法異核單量子相關(guān)光譜（HSQC）；異核多平衡相關(guān)譜（HMQC）；異核多鍵相關(guān)譜（HMBC）；全空間相關(guān)法核超限效應(yīng)譜（NOESY）。 利用異核相關(guān)，例，1H與氮（15N）、碳（13C）或存在磷（31P）的情況下，提供了一種信息途徑，但存在明顯的局限性，即15N（0.37%）和13C（1.1%）的豐度較低，而且大多數(shù)代謝物不含31P。Ø因此，核磁共振波譜的一個(gè)固有問(wèn)題是靈敏度相對(duì)較低。 技術(shù)改進(jìn)：超導(dǎo)低溫探針（探測(cè)器冷卻到接近絕對(duì)零溫度）、增加磁場(chǎng)強(qiáng)度（目前為900MHz）和低體積微探針，繼續(xù)提高核磁共振波譜的靈敏度。 核磁共振波譜技術(shù)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：跨實(shí)驗(yàn)室的高度再現(xiàn)性；通常允許以無(wú)創(chuàng)或微創(chuàng)的方式收集樣品，例如尿液、血液和精液；需要少量樣品和最少或無(wú)樣品制備；快速；無(wú)損。 因此，隨著時(shí)間的推移，有可能從同一個(gè)體中采集多個(gè)樣本，從而繪制特定病理生理?xiàng)l件下發(fā)生的代謝變化圖。作為一個(gè)獨(dú)特的特征，這些樣品隨后可以重復(fù)用于進(jìn)一步的分析，例如轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等。以上優(yōu)勢(shì)同樣適用于高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)（HRMAS）核磁共振波譜（HRMASNMR）。 HRMAS NMR：基本上是分析完整組織的唯一方法。在沒(méi)有任何預(yù)處理的情況下，樣品以54.7°的“魔角”相對(duì)于外加磁場(chǎng)快速旋轉(zhuǎn)，這降低了完整組織的核磁共振譜線的展寬，因此與流體獲得的分辨率相當(dāng)。 3. 質(zhì)譜（MS） 3.1 質(zhì)譜法 質(zhì)譜法是通過(guò)測(cè)量電離分子在磁場(chǎng)中低壓（真空）下的質(zhì)量電荷比（質(zhì)荷比：m/z）來(lái)研究分子結(jié)構(gòu)的方法。 質(zhì)譜儀由三個(gè)基本組件組成：離子源、質(zhì)譜分析儀和檢測(cè)器。 為了避免空氣中分子的影響，真空是必不可少的。 離子源使樣品（氣體、液體或固體）電離，產(chǎn)生分子離子和更小的碎片離子。這些離子通過(guò)質(zhì)量分析儀加速，垂直磁場(chǎng)將根據(jù)其質(zhì)量使離子偏轉(zhuǎn)；較重的離子不會(huì)像較輕的離子那樣偏轉(zhuǎn)，從而允許質(zhì)量分析儀根據(jù)其質(zhì)量電荷比對(duì)離子進(jìn)行排序，最終由檢測(cè)器測(cè)量。 輸出以質(zhì)譜表示，其中每個(gè)峰或條代表一個(gè)具有特定m/z（x軸）的離子，峰的長(zhǎng)度代表相對(duì)豐度。 3.2 物質(zhì)的電離 質(zhì)譜的一個(gè)固有問(wèn)題是只能分析氣相中的離子，電離過(guò)程決定了可以區(qū)分的代謝物的類型和數(shù)量。 沒(méi)有一種單一的電離過(guò)程可以涵蓋所有類型的代謝物。 電離技術(shù)：電子電離（EI）和化學(xué)電離（CI），它們只能電離氣相分子，電噴霧電離（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸/電離（MALDI）適用于熱不穩(wěn)定和非揮發(fā)性分析物，如液體和固體。 其他電離技術(shù)：快速原子轟擊（FAB）、場(chǎng)解吸（FD）、激光電離（LIMS）和共振電離（RIMS）。 基于MS的代謝組學(xué)的一個(gè)關(guān)鍵因素是，如果采用非靶向方法，則獨(dú)立地應(yīng)用不同的電離程序，以實(shí)現(xiàn)最大的代謝物覆蓋率，反之，為靶向研究選擇正確的電離方法。 3.3 質(zhì)量分析器 質(zhì)量分析器根據(jù)離子的質(zhì)荷比對(duì)其進(jìn)行排序，并通過(guò)磁場(chǎng)或電場(chǎng)對(duì)其進(jìn)行分類。 與電離過(guò)程一樣，不同的分析儀類型也被開(kāi)發(fā)出來(lái)，每種類型都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。 一些最常用的分析器是飛行時(shí)間（TOF）、四極質(zhì)量濾波器、四極離子阱、傅里葉變換離子回旋共振和軌道捕獲。 3.4 檢測(cè)器 探測(cè)器，它測(cè)量通過(guò)離子的電荷。 因此，在給定的代謝組學(xué)研究中，必須仔細(xì)選擇質(zhì)譜儀，以獲得高靈敏度和高選擇性，并進(jìn)行準(zhǔn)確的分子鑒定。 準(zhǔn)確的分子鑒定可以通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜來(lái)實(shí)現(xiàn)，串聯(lián)質(zhì)譜是一種能夠進(jìn)行多輪質(zhì)譜的質(zhì)譜儀，可以進(jìn)行碎片研究和非常精確的質(zhì)量測(cè)定。 有時(shí)，質(zhì)譜儀的一些更常見(jiàn)的配置變得普遍，形成復(fù)合縮寫(xiě)，如TIMS（熱電離質(zhì)譜）和MALDI-TOF（基質(zhì)輔助激光解吸/電離和飛行時(shí)間）。 3.5 質(zhì)譜法面臨的問(wèn)題 盡管質(zhì)譜技術(shù)不斷進(jìn)步，但由于可變電離和離子抑制效應(yīng)影響分析物的精確定量，分析高度復(fù)雜樣品時(shí)仍然存在一個(gè)固有問(wèn)題。為了部分地彌補(bǔ)這些局限性，采用不同的技術(shù)來(lái)降低質(zhì)譜前分析物的復(fù)雜性。 最常用的技術(shù)是色譜和電泳。 4. 液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS） 4.1 LC-MS聯(lián)用概述 液相色譜法使用液體，通常是水和有機(jī)溶劑的混合物，在高壓下工作，因此被稱為高效液相色譜（HPLC）。 在高效液相色譜過(guò)程中，給定的樣品在高壓下被液體強(qiáng)制通過(guò)色譜柱。柱本身包含一種固體吸附材料，根據(jù)其與吸附材料相互作用程度的不同，該材料將減慢化合物的通過(guò)，從而分離單個(gè)物質(zhì)，提供不同的保留時(shí)間。通過(guò)改變色譜柱和液體，可以分離出不同種類的物質(zhì)，然后引入質(zhì)譜儀。 最常用的高效液相色譜法是反相高效液相色譜法（RP-HPLC），但極性和離子性化合物很難用這種方法檢測(cè)，這就是為什么親水性相互作用液相色譜法（HILIC）已被開(kāi)發(fā)用于帶電代謝物的分析。近年來(lái)，超高性能LC（UHPLC）已經(jīng)提高了峰值分辨率，提高了速度和靈敏度。 5. 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS） 5.1 GC-MS聯(lián)用概述 氣相色譜法是一種簡(jiǎn)單的色譜法，用于分離和分析揮發(fā)性成分。 氣相色譜儀基本上是一個(gè)柱，惰性氣體（通常是氦）通過(guò)它在高溫下吹氣。一個(gè)給定的樣品會(huì)因此蒸發(fā)，揮發(fā)性分子被推過(guò)色譜柱，在那里它們與色譜柱的涂層相互作用。每種化合物在通過(guò)色譜柱時(shí)與涂層發(fā)生不同的相互作用，導(dǎo)致不同的保留時(shí)間，從而在揮發(fā)性分子被引入質(zhì)譜儀之前提供有效的分離。 該方法的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是可以設(shè)計(jì)柱分離感興趣的特定分析物，但GC的一個(gè)限制和先決條件是分析物在高溫下易揮發(fā)和穩(wěn)定。代謝物的覆蓋范圍可以通過(guò)非揮發(fā)性分子的化學(xué)衍生來(lái)提高，但代價(jià)是在代謝物組學(xué)數(shù)據(jù)中引入另一個(gè)變量。然而，許多代謝物仍然不易揮發(fā)，因此不能用GC-MS定量。 6. 毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜（CE-MS） 6.1 CE-MS聯(lián)用概述 毛細(xì)管電泳是代謝組學(xué)中一種相對(duì)較新但功能強(qiáng)大的分析工具，它能快速、高分辨率地分析核酸、氨基酸、羧酸和糖磷酸酯等帶電的代謝物質(zhì)。 使用毛細(xì)管電泳，來(lái)自給定樣品的帶電分析物將通過(guò)電極間電場(chǎng)引發(fā)的毛細(xì)管遷移。帶電分析物根據(jù)其電泳遷移率進(jìn)行分離，這意味著如果兩個(gè)帶電分析物具有相同的尺寸，則具有較大電荷的分析物將移動(dòng)得更快；或者如果兩個(gè)分析物具有相同的電荷，則較小的分析物將由于較少的摩擦而移動(dòng)得更快。 到目前為止，CE-MS主要用于分子的研究，但在處理極性強(qiáng)、帶電荷的代謝物時(shí)，CE通常是首選，出于對(duì)結(jié)果快速需求。 7. 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的化學(xué)計(jì)量方法 7.1 數(shù)據(jù)的預(yù)處理 不同的分析平臺(tái)產(chǎn)生了大量復(fù)雜的數(shù)據(jù)。 為了能夠提取出任何有意義的信息，需要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行降噪、基線校正、峰值對(duì)齊、分箱（binning）、標(biāo)準(zhǔn)化（歸一化）和數(shù)據(jù)縮放等預(yù)處理。 正確的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)預(yù)處理是獲得有效信息數(shù)據(jù)的前提。 7.2 化學(xué)計(jì)量方法概述 預(yù)處理后的數(shù)據(jù)可以進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)，這是統(tǒng)計(jì)方法在化學(xué)系統(tǒng)中的應(yīng)用，目的是提取有意義的信息。 它已經(jīng)成為代謝組學(xué)的一個(gè)重要組成部分，因?yàn)楹舜殴舱窈唾|(zhì)譜都產(chǎn)生高維數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，與變量（峰或代謝物）相比，觀測(cè)（樣品）相對(duì)較少，使得這類數(shù)據(jù)適合于多元統(tǒng)計(jì)分析。 多元分析工具的目標(biāo)是將數(shù)據(jù)集的復(fù)雜性或維數(shù)降低到一個(gè)更易于管理的二維或三維數(shù)。在代謝組學(xué)中，最廣泛使用的技術(shù)是以無(wú)監(jiān)督或有監(jiān)督的方式提取潛在變量。 7.3 PCA分析（主成分分析） 主成分分析（PCA）是最實(shí)用的無(wú)監(jiān)督方法，它通過(guò)提取主要的變異源，在不知道數(shù)據(jù)所屬類別的情況下，降低了數(shù)據(jù)的復(fù)雜度。 PCA對(duì)于檢測(cè)異常值和樣本的內(nèi)在聚類非常有用，內(nèi)在聚類對(duì)于隨后在分組樣本中識(shí)別相似的生物特征非常有用。 7.4 偏最小二乘判別分析（PLS-DA） 偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交PLS-DA（O-PLS-DA）是常用的監(jiān)督方法，能夠發(fā)現(xiàn)兩個(gè)矩陣之間的基本關(guān)系，一個(gè)X矩陣包含自變量（例如，光譜強(qiáng)度值）來(lái)自樣本和包含因變量的Y矩陣（例如，類別、性別、治療反應(yīng)） PLS-DA和O-PLS-DA通常用于識(shí)別不同樣本組之間的生物標(biāo)記物和差異，例如健康組和患病組。 使用PCA、PLS-DA和O-PLS-DA時(shí)，存在數(shù)據(jù)過(guò)度過(guò)濾的風(fēng)險(xiǎn)，因此必須進(jìn)行嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證。 |
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