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victor_u新蟲 (小有名氣)
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利用親和層析純化蛋白 已有3人參與
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利用蛋白純化儀UEV 25D對樣品進(jìn)行親和層析 純化步驟 1. 將親和介質(zhì)在緩沖液中進(jìn)行平衡。 2. 選擇有利于將目標(biāo)分子專一性結(jié)合到其互補(bǔ)的結(jié)合物質(zhì)（配基）的條件，對樣品進(jìn)行純化。目標(biāo)物質(zhì)具有專一性，可逆的結(jié)合到配基上，并且未被結(jié)合的 物質(zhì)可以被沖洗流出柱子。 3. 回收目標(biāo)分子，改變緩沖液的條件，將結(jié)合的目標(biāo)分子洗脫下來。 洗脫這一步可以是選擇利用競爭性配基進(jìn)行特異性洗脫或者改變緩沖液的pH值、離子強(qiáng)度和極性進(jìn)行非特異性洗脫。 目標(biāo)蛋白是以純化的濃縮的形式被收集起來的。 4. 用結(jié)合緩沖液對親和介質(zhì)進(jìn)行再平衡。 介質(zhì)和緩沖液的準(zhǔn)備 在使用親和介質(zhì)進(jìn)行純化時(shí)，必須先徹底清洗掉親和介質(zhì)的儲存液和防腐劑。 使用0.45微米或者0.22微米的濾膜對緩沖液進(jìn)行過濾，并在進(jìn)行純化之前去除緩沖液中的氣體。 樣品的制備 應(yīng)確保去除掉樣品中已知的對結(jié)合有干擾作用的組分。 在上樣過程中，需要對樣品的流速進(jìn)行測試，特定的流速可以增加樣品的結(jié)合效果。當(dāng)樣品與親和介質(zhì)的相互作用較弱時(shí)，需要較長的時(shí)間才能達(dá)到平衡，這時(shí)可在上樣完畢后停止流速，這樣在洗脫前就可以有更多的時(shí)間使目標(biāo)蛋白與配基相互作用，然后再繼續(xù)洗脫�；蛘呖梢詫悠贩峙蠘樱加欣谀繕�(biāo)蛋白與配基的結(jié)合。 洗脫 在所有未被結(jié)合的物質(zhì)都被緩沖液洗出柱子后（在280 nm紫外吸光度下不再出峰），再開始對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行洗脫，可以提高被洗脫的目標(biāo)物的純度。 當(dāng)樣品與親和介質(zhì)的相互作用較強(qiáng)時(shí)，在開始洗脫后（一般為10 min – 2 h），可以停止流動一段時(shí)間，然后再繼續(xù)洗脫。這樣將會有更多時(shí)間使目標(biāo)蛋白與配基之間解吸附，可以提高目標(biāo)蛋白的回收率。 pH洗脫 pH值的變化可以改變帶電荷的配基基團(tuán)和/或結(jié)合蛋白的離子化程度，這一改變或許通過影響它們的結(jié)合位點(diǎn)，降低它們之間的親和性，或者是通過改變構(gòu)象導(dǎo)致間接的改變它們之間的親和性。 離子強(qiáng)度洗脫 通過改變離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫取決于配基和目標(biāo)蛋白之間特殊的相互作用。這個(gè)洗脫方法較為溫和，通過逐漸增加離子強(qiáng)度緩沖液（一般為NaCl）達(dá)到洗脫的目的，一般在洗脫中用線性梯度洗脫或者階梯式洗脫。 競爭性洗脫 選擇性的洗脫經(jīng)常用于分離一組特殊的培養(yǎng)基物質(zhì)或者應(yīng)用在當(dāng)配基/目標(biāo)蛋白的親和力相對較高時(shí)。此種方法是基于洗脫劑與目標(biāo)蛋白競爭結(jié)合配基的位點(diǎn)或者與配基競爭結(jié)合目標(biāo)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。 當(dāng)用競爭的方式進(jìn)行洗脫時(shí)，競爭化合物的濃度應(yīng)該與配基的濃度相似。但如果競爭的化合物與配基的結(jié)合力比目標(biāo)分子與配基的結(jié)合力更弱時(shí)，應(yīng)使用高于配基濃度十倍的競爭化合物的濃度進(jìn)行洗脫。 在較低的洗脫液極性的條件下有助于目標(biāo)洗脫物不失活，典型類型有二氧雜環(huán)己烷（10%）或者乙二醇（50%）。 在其他洗脫方法都失敗的情況下，可以嘗試改變緩沖液形式使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，例如促溶劑，如鹽酸胍、尿。但可能使洗脫的蛋白發(fā)生變性，最好能夠避免使用。 |
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