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victor_u新蟲 (小有名氣)
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關(guān)于293細(xì)胞培養(yǎng)的幾點(diǎn)認(rèn)識(shí) 已有1人參與
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培養(yǎng)293細(xì)胞對(duì)于熟練掌握細(xì)胞培養(yǎng)的人來說不是問題，但是對(duì)于小白來說總會(huì)出現(xiàn)這樣那樣的問題。而且一般遇到的也不是個(gè)別問題，大都是小白一開始都會(huì)遇到的普遍問題。所以，這個(gè)時(shí)候要盡可能的先考慮自身的操作是否規(guī)范，排除掉操作問題之后如果還沒有解決問題，再考慮細(xì)胞本身的因素。 根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)以下幾點(diǎn)需要注意的地方： 一、首先293細(xì)胞養(yǎng)的好與不好關(guān)鍵的決定因素還是在于人，也就是操作者的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。有多年的細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)的人比新手當(dāng)然比一樣，大家都很認(rèn)真，但是效果卻不同，所以實(shí)驗(yàn)者的操作技能是決定性的因素。 二、293細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞接種密度應(yīng)大于一般的細(xì)胞，也就是能1瓶接種的就不要接種2瓶。 三、處置不要太過于頻繁或積極，處理上冷淡些（也就是減少對(duì)它的過多刺激）反而回獲得好的生長效果。 四、在細(xì)胞生長過度時(shí)再傳代，一般的細(xì)胞長到80-90%即可傳代，而293細(xì)胞長到100%甚至更高時(shí)傳代有利于其生長和活力的保持。一般的細(xì)胞2天可傳代，293細(xì)胞一般建議不少于3天。 五、并非只能用DMEM，像用1640這樣的都可以，同樣培養(yǎng)的很好。 293細(xì)胞培養(yǎng)特性： 一、293細(xì)胞明顯適應(yīng)酸性環(huán)境,pH值在6.9～7.1時(shí),可順利貼壁生長, 換液時(shí)動(dòng)作要輕。一般用高糖的DMEM培養(yǎng)基。 二、傳代：倒去廢液，PBS洗一次（輕），用0.02%EDTA與0.25%Trypsin消化，生長良好細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中輕搖,使之流遍所有細(xì)胞表面,即將其吸除或棄去消化30s，然后吸去，再讓剩下的EDTA/Trypsin作用30s,鏡下觀察細(xì)胞變圓,就可加DMEM終止消化，反復(fù)吹打至細(xì)胞全成單個(gè)懸浮細(xì)胞即可。12小時(shí)-24小時(shí)90%以上細(xì)胞貼壁。293細(xì)胞傳代時(shí)機(jī)為達(dá)80-90%匯合，傳代比例為1：3。 三、293細(xì)胞在低代時(shí)容易貼壁，生長良好，在傳到幾十代以后，易聚集成團(tuán)，且貼壁不牢，用PBS沖洗時(shí)即可能脫落，即使消化后也不容易吹打成單細(xì)胞懸液，最好購入時(shí)先大量凍存。 四、復(fù)蘇 293細(xì)胞的另一生長特性是貼壁所需時(shí)間長且貼壁不牢。細(xì)胞冷凍后復(fù)蘇時(shí),都有不同程度的腫脹,若以50ml培養(yǎng)瓶待細(xì)胞長滿瓶底的70%～80%時(shí)消化凍存,復(fù)蘇時(shí)將其全部接種至2個(gè)50ml瓶中時(shí)較為合適。剛復(fù)蘇的293貼壁很慢，復(fù)蘇接種后24小時(shí)內(nèi),應(yīng)盡量減少觀察細(xì)胞次數(shù)或不作觀察,以免因晃動(dòng)而影響細(xì)胞貼壁。復(fù)蘇后48小時(shí)左右觀察貼壁情況并進(jìn)行首次更換培養(yǎng)基比較合適,如果用一次性塑料培養(yǎng)瓶可增加細(xì)胞貼壁牢度。換液前宜將培養(yǎng)基預(yù)熱。 五、轉(zhuǎn)染：體外應(yīng)用293細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，如果是采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染，一定要注意293細(xì)胞不要全部長滿細(xì)胞培養(yǎng)盤，長滿細(xì)胞時(shí)加入磷酸鈣就會(huì)使293細(xì)胞大片的脫落，最好是當(dāng)293生長到1/2或2/3時(shí)進(jìn)行磷酸鈣轉(zhuǎn)染，可以避免細(xì)胞的大量脫落。 其它的經(jīng)驗(yàn)： 一、用大瓶培養(yǎng)較小瓶要好，可能是更有利于293均勻的分布，利于營養(yǎng)的攝取 二、培養(yǎng)液要新鮮，每次只配1000ml，分為2-4瓶，不用的培養(yǎng)液，凍存在-20度， 三、要及時(shí)傳代，最好是細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶底部，但是細(xì)胞之間還沒有完全貼緊，總是多少有空隙的時(shí)候最好。 四、如果細(xì)胞貼壁不好，可能是消化過久，或是培養(yǎng)瓶不夠干凈，當(dāng)然要除外細(xì)胞污染。 五、如果使用用玻璃培養(yǎng)瓶或皿，可以采用高壓滅菌的0.2%明膠溶液預(yù)處理培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿，方法是將明膠加入培養(yǎng)皿，使之浸泡到底面的各個(gè)部分，然后吸出，置超凈臺(tái)內(nèi)晾干即可使用。這樣處理后細(xì)胞貼壁效果好且鏡下細(xì)胞立體感強(qiáng)。如果是新的塑料培養(yǎng)瓶就不用處理。 以上是我的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)之談，若能對(duì)您有益將是我的心愿。 |
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