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XM沐沐新蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
關(guān)于質(zhì)粒重組，請(qǐng)教大佬們~ 已有2人參與
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| 合成的引物，退火用klenow fragment補(bǔ)齊，酶切后用T4連接酶插入到相同酶切的質(zhì)粒中，通過(guò)DH5α轉(zhuǎn)化，沒(méi)有菌落長(zhǎng)出，是什么問(wèn)題��？是質(zhì)粒重組沒(méi)有連接上么？ |
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雨獨(dú)步
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【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
XM沐沐: 金幣+10, ★★★很有幫助 2020-01-17 17:01:37
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
XM沐沐: 金幣+10, ★★★很有幫助 2020-01-17 17:01:37
| 如果平板抗性沒(méi)錯(cuò)的話，一般即使自連或者載體沒(méi)切干凈也會(huì)長(zhǎng)幾個(gè)，感受態(tài)的效率有問(wèn)題嗎？另外，看你的描述是想將一個(gè)很小的片段連到載體上，那為什么不把這個(gè)片段設(shè)在引物5'端，引物3'端是載體上的片段（正反向引物用同樣的酶切位點(diǎn)），然后擴(kuò)增出整個(gè)載體片段，回收后酶切自連。 |
2樓2020-01-16 13:03:42
liling0601
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3樓2020-01-17 13:32:24
原海亮
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【答案】應(yīng)助回帖
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導(dǎo)致沒(méi)有菌生長(zhǎng)的原因有很多，比如，片段酶切處理不完全、載體處理不完全、連接效率過(guò)低、感受態(tài)細(xì)胞效率低下等等。如果想找到原因還是建議做一些對(duì)照實(shí)驗(yàn)，比如可以用空載轉(zhuǎn)感受態(tài)，驗(yàn)證感受態(tài)細(xì)胞效率，通過(guò)載體自連轉(zhuǎn)化驗(yàn)證載體處理效果等。 大家經(jīng)常面對(duì)的是假陽(yáng)性比較多，即載體自連。對(duì)于樓主出現(xiàn)的連一個(gè)菌都不長(zhǎng)的情況，首先確定平板抗性正確，然后使用空載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證感受態(tài)細(xì)胞的效率，當(dāng)然如果感受態(tài)細(xì)胞其他人用著可以，那就不用做該對(duì)照。 不太清楚樓主的實(shí)驗(yàn)?zāi)康�，描述的比較簡(jiǎn)單，且“合成的引物，退火用klenow fragment補(bǔ)齊”是pcr擴(kuò)增基因產(chǎn)物？我沒(méi)做過(guò)，所以不太清楚表達(dá)的意思。 其實(shí)轉(zhuǎn)化的主要因素就是：片段、載體、連接體系 pcr片段進(jìn)行酶切時(shí)候，最容易出現(xiàn)酶切不完全的情況，因?yàn)榍邢聛?lái)的堿基少，電泳無(wú)法分辨�？梢钥紤]連接T載體后，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切，這樣可以通過(guò)電泳檢測(cè)片段是否酶切完全。 載體也同樣存在酶切是否完全的問(wèn)題，特別雙酶切的時(shí)候，很多判斷是否兩個(gè)酶都酶切完全。這時(shí)候我們一般會(huì)適當(dāng)?shù)脑黾用噶亢蜁r(shí)間，但這一般不會(huì)導(dǎo)致一個(gè)菌都不長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)載體自連情況。 接下來(lái)就是連接，我建議在進(jìn)行片段和載體連接前，一定進(jìn)行電泳檢測(cè)你的片段和載體濃度，因?yàn)槲覀冎熬统霈F(xiàn)過(guò)，對(duì)片段載體膠回收后進(jìn)行連接效率很低，后來(lái)發(fā)現(xiàn)回收的片段濃度電泳都看不到，所以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，還是做個(gè)電泳檢測(cè)，如果片段濃度可以，那就盡量多的加入片段，載體有一點(diǎn)即可，可以增加轉(zhuǎn)化子的陽(yáng)性數(shù)。 |
4樓2020-04-08 14:26:18
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