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如何選擇一抗？
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如何選擇一抗 一抗：可以特異結(jié)合底物，就是識別出我們想要檢測的東西。檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，那怎樣在多種多樣的抗體中，選擇自己實驗需要的抗體呢？主要考慮如下幾種因素：分析自己實驗應(yīng)用的實驗方法是哪種？分析自己實驗中標(biāo)本的種屬是哪種動物或人的？分析樣本中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，分析抗體的標(biāo)記和檢測，分析抗體的宿主來源種屬等等。 1. 分析自己實驗應(yīng)用的實驗方法 一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)試驗驗證過適用于何種分析類型，如：可以應(yīng)用于WB、IHC、ICC、ELISA、FCM分析等。如果抗體說明書沒有提及的應(yīng)用類型，并不意味著該抗體不適用于此種分析應(yīng)用類型，而僅是說明尚未經(jīng)過此種分析試驗驗證。為了避免實驗風(fēng)險，當(dāng)說明書中沒有提及的應(yīng)用方法時，可申請測試裝，進(jìn)行測試后，再決定是否購買。如果抗體不適用某些分析試驗，則會在抗體說明書上標(biāo)注出來不適于某分析試驗。 2. 分析自己實驗中標(biāo)本的種屬 一般抗體說明書都列出該抗體經(jīng)試驗驗證過適用于何種動物或人的標(biāo)本，如：可以用于rat、mouse、human、pig、goat等動物的標(biāo)本的實驗。也就是說應(yīng)選擇物種相同或有交叉反應(yīng)的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應(yīng)，因其氨基酸序列同源性較高。 如果樣本的種類未列入抗體說明書上的交叉反應(yīng)種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測驗證過。為了避免實驗風(fēng)險，盡量不要使用說明書中沒有提及的標(biāo)本的種屬的抗體。 或者通過序列比對的方法來預(yù)測交叉反應(yīng)，可應(yīng)用Expasy和NCBI BLAST來進(jìn)行不同物種蛋白同源性比對。如果比對結(jié)果，證明同源性比較高的，也可以選擇。 3. 分析樣本中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性 了解樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有助于選擇最合適的抗體，至少兩方面因素需要考慮待測樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域：抗體是由各種不同免疫原免疫宿主而制備得來，其中的免疫原包括：全長蛋白、蛋白片斷、多肽、全有機(jī)體（如：細(xì)菌）或細(xì)胞，抗體說明書一般都有免疫原的描述，如果打算檢測的是蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區(qū)域，則必須選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。如果打算用FCM流式檢測活細(xì)胞的表面蛋白，則需要選擇含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。 樣本的提取或處理過程：某些抗體要求樣本經(jīng)過某些特殊處理，例如：許多抗體只識別還原和變性的、表位已暴露不受二級四級結(jié)構(gòu)阻礙的蛋白樣本，另一方面，某些抗體僅識別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當(dāng)選擇免疫組化的抗體時，應(yīng)注意某些抗體只識別未固定的冷凍的組織，而另一些抗體則適用于無需抗原修復(fù)解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，這些都會在抗體說明書上應(yīng)用部分標(biāo)示出來。 4. 抗體宿主物種的選擇 一般說來，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無偶聯(lián)物的一抗時，一抗宿主動物的物種選擇較為重要，對于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應(yīng)，例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應(yīng)選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對不含IgG的細(xì)胞裂解物樣本的western blotting檢測，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含IgG，在western blot檢測中則結(jié)合出現(xiàn)IgG分子50 and 25 kDa的重鏈和輕鏈條帶。 |
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longwave2樓
2019-12-31 08:27
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祝福 發(fā)自小木蟲Android客戶端
tzynew3樓
2019-12-31 08:40
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8 發(fā)自小木蟲Android客戶端
2019-12-31 09:58
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youngen5樓
2019-12-31 12:23
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psylhh6樓
2019-12-31 20:49
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nono20097樓
2019-12-31 21:03
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2020-01-02 08:06
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星城石墨9樓
2020-01-03 13:45
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尚輯SCI10樓
2020-05-15 10:17
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