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[交流]
雙交換問題
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| 最近在做pre112自殺質(zhì)粒大腸桿菌基因敲除 單交換已經(jīng)做出來了 pcr2條帶 大小也對 現(xiàn)在在10%蔗糖作用下雙交換篩選 已經(jīng)培養(yǎng)了7代了 大概有50%幾率出現(xiàn)疑似陽性菌 挑了幾十個疑似陽性菌pcr驗證結(jié)果全是野生型，求大佬指點一下怎么破 就只能一個個篩選 靠工作量選嗎 有什么技巧嗎 有點難受啊 |
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5樓2019-12-06 06:20:00
9樓2019-12-06 08:43:51
10樓2019-12-06 09:00:56
11樓2019-12-06 11:35:44
17樓2020-06-24 15:57:52
★
xydlengyue(金幣+1): 謝謝參與
xydlengyue(金幣+1): 謝謝參與
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同學(xué)你好，我最近也在用pre112自殺質(zhì)粒做基因敲除 ，單交換我只能擴(kuò)出一條帶，還有就是蔗糖誘導(dǎo)丟失后的幾百個單菌落都有氯霉素抗性，可以給我點建議嗎？萬分感謝！ 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
18樓2021-11-12 00:40:30
19樓2023-03-24 00:01:26
你好，請問該問題解決了嗎？求教一下有什么方法嗎20樓2025-05-22 16:25:53
★
xydlengyue(金幣+1): 謝謝參與
xydlengyue(金幣+1): 謝謝參與
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1. 驗證sacB系統(tǒng)的有效性 原理：sacB基因在蔗糖存在時表達(dá)果聚糖蔗糖酶，產(chǎn)生對大腸桿菌有毒的果聚糖。只有發(fā)生雙交換（丟失sacB）的菌才能存活。 實驗驗證： 將單交換菌（含sacB）涂布到含10%蔗糖的平板上，同時設(shè)置不含蔗糖的對照。 如果單交換菌在蔗糖平板上無法生長，說明sacB系統(tǒng)正常；若生長良好，則sacB可能失效（需檢查質(zhì)粒構(gòu)建或培養(yǎng)條件）。 2. 優(yōu)化雙交換篩選條件 蔗糖濃度與傳代次數(shù)： 確認(rèn)文獻(xiàn)中推薦的蔗糖濃度（通常為5-10%），可嘗試提高濃度至10%-15%以增強(qiáng)選擇壓力。 延長傳代時間至10代以上，確保質(zhì)粒完全丟失。 液體富集法： 在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行多次傳代（含蔗糖、無抗性），富集雙交換菌后再涂板，提高陽性克隆比例。 3. 檢查PCR驗證方法 引物設(shè)計： 設(shè)計兩對引物：外側(cè)引物（同源臂外側(cè)）和內(nèi)側(cè)引物（靶基因內(nèi)部），確保雙交換后擴(kuò)增出預(yù)期條帶（如靶基因缺失）。 示例：野生型擴(kuò)增長度較大，雙交換后片段縮短（或反之）。 對照設(shè)置： 使用野生型和單交換菌作為對照，確認(rèn)PCR區(qū)分能力。 測序驗證： 對部分PCR產(chǎn)物測序，確認(rèn)是否發(fā)生預(yù)期重組。 4. 排除抗性干擾 確保雙交換篩選過程中完全去除抗生素，避免殘留抗性導(dǎo)致未丟失質(zhì)粒的菌生長。 5. 提高雙交換效率 同源臂長度優(yōu)化： 確保同源臂足夠長（通常500-1000 bp），短于200 bp可能導(dǎo)致重組效率低下。 使用重組增強(qiáng)菌株： 采用表達(dá)λ Red重組酶（如BW25113/pKD46）的菌株，提高同源重組效率。 溫度誘導(dǎo)： 若使用溫度敏感型質(zhì)粒，調(diào)整培養(yǎng)溫度（如30℃→42℃）誘導(dǎo)質(zhì)粒丟失。 6. 排除回復(fù)突變或污染 嚴(yán)格無菌操作： 避免野生型菌污染，尤其在傳代過程中。 表型驗證： 結(jié)合靶基因功能（如抗性丟失、代謝缺陷）進(jìn)行表型驗證（如藥敏試驗）。 7. 嘗試替代篩選策略 雙重篩選標(biāo)記： 使用sacB聯(lián)合其他負(fù)篩選標(biāo)記（如rpsL、ccdB）提高篩選特異性。 抗生素梯度平板： 結(jié)合抗生素濃度梯度，篩選完全丟失質(zhì)粒的菌落。 總結(jié)建議 優(yōu)先驗證sacB系統(tǒng)，確認(rèn)蔗糖篩選條件有效。 優(yōu)化PCR引物設(shè)計，確保能區(qū)分雙交換與野生型。 延長傳代次數(shù)至10代以上，結(jié)合液體富集提高陽性率。 若問題持續(xù)，考慮更換同源臂或使用重組增強(qiáng)菌株。 通過系統(tǒng)排查和優(yōu)化，可顯著提高雙交換篩選成功率，減少無效工作量的消耗。如果仍無進(jìn)展，建議查閱相關(guān)文獻(xiàn)（如Datsenko & Wanner, 2000）或咨詢實驗室前輩獲取經(jīng)驗參數(shù)。 |
21樓2025-05-26 14:38:05
簡單回復(fù)
2019-12-06 02:22
回復(fù)
xydlengyue(金幣+1): 謝謝參與
nono20093樓
2019-12-06 02:51
回復(fù)
xydlengyue(金幣+1): 謝謝參與
。 發(fā)自小木蟲Android客戶端
tzynew4樓
2019-12-06 05:52
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xydlengyue(金幣+1): 謝謝參與
2019-12-06 07:58
回復(fù)
2019-12-06 08:03
回復(fù)
2019-12-06 08:13
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psylhh12樓
2019-12-06 21:20
回復(fù)
xydlengyue(金幣+1): 謝謝參與
xiaoqiuqiu2013樓
2019-12-06 23:12
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xydlengyue(金幣+1): 謝謝參與
syhorchid14樓
2019-12-06 23:23
回復(fù)
miaojiabing15樓
2019-12-09 08:18
回復(fù)
xydlengyue(金幣+1): 謝謝參與
xydlengyue16樓
2019-12-09 21:12
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