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sgRNA構(gòu)建建議教程 1， 引物設(shè)計，https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/； 2， 引物退火，引物稀釋到20nM，正反向引物分別取10ul混合，取0.5-1L水加熱到沸騰，混合后引物放入，自然冷卻到室溫（2-4小時）； 3， 酶切連接，取200ng質(zhì)粒（不用太多，減少自連），取5ul退火的引物，T4連接酶和內(nèi)切酶10×bufffer分別取0.5ul，ddH2O補(bǔ)到10ul 4， PCR儀器設(shè)置程序（時間緊張可以減少循環(huán)數(shù)或者減少循環(huán)內(nèi)時間） 1)，37℃ 5min 2)，37℃ 5min 3)，16℃ 10min 第2,3步15-20個循環(huán) 4)，16℃ 10min 5， 產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化； 6， PCR檢測，用sgRNA引物，配合載體上引物PCR檢測； 7， 送測序 |
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2019-12-05 09:35:48, 84.52 K
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