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多肽偶聯(lián)
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多肽偶聯(lián)蛋白 對(duì)在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng)而言，大多數(shù)多肽的分子量都太小。將多肽與載體蛋白如KLH等偶聯(lián)之后，不僅能增加抗原的大小，也能增強(qiáng)免疫性。我們可以提供與KLH,BSA和OVA蛋白的偶聯(lián)。大多數(shù)客戶選擇與KLH交聯(lián)，因?yàn)镵LH的免疫性更好，而且BSA在很多實(shí)驗(yàn)中作為Blocking試劑，由于動(dòng)物體內(nèi)既會(huì)產(chǎn)生對(duì)多肽的抗體也會(huì)產(chǎn)生對(duì)載體蛋白的抗體，這樣會(huì)出現(xiàn)假陽性。 KLH，BSA,OVA是分子量十分巨大的蛋白，有幾百萬Da，所以在其分子表面有大量的活性基團(tuán)，最常用于偶聯(lián)的是伯胺基團(tuán)。小的多肽通常也帶有不同基團(tuán)可以用于偶聯(lián)，常用的有伯胺基團(tuán)，羧基和巰基。 多肽與KLH的偶聯(lián)就是利用這些基團(tuán)，再通過交聯(lián)劑(crosslinker)，將多肽上的巰基/羧基/伯胺與KLH上的伯胺相連，從而形成共價(jià)偶聯(lián)，制備成完全抗原，用于免疫動(dòng)物獲得抗體。 所以偶聯(lián)的伯胺應(yīng)該是來自于賴氨酸側(cè)鏈和N端，而偶聯(lián)的羧基則來自于天冬氨酸，谷氨酸和C端，巰基則來自于半胱氨酸。 至于偶聯(lián)上去的數(shù)量，和加入的肽段，交聯(lián)劑，KLH的摩爾比例有關(guān)。通常一分子KLH上可能會(huì)偶聯(lián)上百個(gè)肽段。 偶聯(lián)方法 我們用MBS活化載體蛋白，這樣能將載體蛋白上面的自由-SH與多肽末端的Cys的側(cè)鏈-SH連接起來，這種方法直接，特異性高，而且穩(wěn)定，通常選擇對(duì)免疫不重要的一端進(jìn)行交聯(lián)。 EDC活化載體上的-COOH，將載體的-COOH和多肽的-NH2連接起來也是一種可行的方法。但我們只建議在多肽序列中有多個(gè)Cys時(shí)采用該方法。如果肽鏈中含有多個(gè)-COOH或-NH2基因，不建議使用該方法，因?yàn)闀?huì)造成多重點(diǎn)交聯(lián)的情況，使多肽結(jié)構(gòu)受影響。常用載體蛋白除KLH外，還有BSA，OVA等，KLH的優(yōu)勢是它不干擾ELISA或Western Blot等實(shí)驗(yàn)。 KLH偶聯(lián)溶液混濁的原因 KLH是一個(gè)很大的并且聚合的蛋白。因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)和大小，它在水中的溶解度是很有限的，因此是乳狀，這并不影響它的免疫性，這種混濁的溶液可以直接免疫動(dòng)物。 |
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