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ap372767129鐵蟲 (正式寫手)
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[求助]
重組蛋白表達后沒有酶活力 已有1人參與
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各位大神： 我在pET-20b（+）構(gòu)建的一段多糖水解酶基因，但是在25℃條件下分泌表達后，用鎳柱純化，經(jīng)蛋白電泳驗證能證明發(fā)酵液和周質(zhì)空間中的酶蛋白已表達，由于上樣是上清液，能排除是包涵體特征，但是純化的酶沒有酶活力，電泳圖如下（最右側(cè)那條粗條帶是發(fā)酵液中的酶經(jīng)鎳柱純化后的結(jié)果，細胞破壁純化也有一粗條帶）。 我目前有幾個疑問：文獻中報的這個酶表達是在pET15b中，該載體沒有信號肽，是在20℃條件下的胞內(nèi)誘導表達。而我的載體是pET20b（+）是有信號肽的，酶蛋白會被分泌至周質(zhì)空間也有部分滲漏至發(fā)酵液中，不過我的發(fā)酵溫度是25℃。我想問是因為發(fā)酵溫度導致的酶蛋白折疊不正確導致沒有酶活力還是該酶本應該在胞內(nèi)表達才有活力（該酶本身是胞內(nèi)酶，來源沒有信號肽）。之前不表達的問答題剛剛解決又遇到?jīng)]有活力的問題，請各位老師同學指點迷津。 |
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2樓2019-11-06 09:31:04
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