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夏夏Dana新蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR擴(kuò)增一直失敗 已有1人參與
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1、篩選到的菌株，NCBI鑒定菌種類型，最大相似度到達(dá)92%，查找目的基因根據(jù)ORF框設(shè)計(jì)引物，目標(biāo)片段1400多bp，一直擴(kuò)增不出來。 2、一個(gè)菌株中，編碼同一個(gè)酶的基因有三種，僅擴(kuò)增出一個(gè)，另外兩個(gè)一直擴(kuò)增失敗。 請(qǐng)問如何優(yōu)化? |
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3樓2019-10-22 14:34:16
woshishui916
木蟲 (著名寫手)
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2樓2019-10-21 21:15:12
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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樓主你好，根據(jù)你的描述，我建議你首先檢查引物。 可以使用NCBI的primer-BLAST來評(píng)價(jià)你設(shè)計(jì)的引物是否足夠好。 如果引物的特異性沒有問題，并且不存在形成引物二聚體的問題，那么你需要考慮你是否使用了適合你引物的退火溫度。 一對(duì)好的引物，它們的Tm相差不大于5，并且GC含量相似（如果你加了限制性酶切位點(diǎn)，也要考慮進(jìn)去）。一般的退火溫度是引物的Tm－5。 其次，你還需要檢查延伸時(shí)間。根據(jù)不同的聚合酶，它們的擴(kuò)增速度不同，你需要根據(jù)你的目的片段的長(zhǎng)度調(diào)整延伸時(shí)間。以上兩點(diǎn)可以參考你使用的聚合酶說明書來進(jìn)行調(diào)整。 如果你有陽(yáng)性對(duì)照的話（即提取自你BLAST匹配到的菌種的DNA），還可以試著做一個(gè)溫度梯度PCR，來測(cè)試不同的退火溫度，選擇其中更適合你的引物的條件。 此外，你說到“編碼同一個(gè)酶的基因有三種，僅擴(kuò)增出一個(gè)”，意思是同一個(gè)物種當(dāng)中有三個(gè)等位基因？ 它們的CDS序列兩端一樣嗎？如果不一樣需要根據(jù)不同的基因設(shè)計(jì)不同的引物。 預(yù)祝你成功。  有問題歡迎繼續(xù)交流 |
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夏夏Dana
4樓2019-10-23 20:01:55
夏夏Dana
新蟲 (初入文壇)
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5樓2019-10-25 14:54:57
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