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ckck123456新蟲 (初入文壇)
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[交流]
TA克隆一直失敗，我將我的操作現(xiàn)在寫下來，讓大家分析分析問題
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首先是PCR，之后對PCR產(chǎn)物切膠回收，濃度比較低，但也是有明顯條帶的，看亮度是100ng/ul左右，之后加A反應(yīng)，我在操作過程中在冰盒上完全溶解后放在4度的條件下，之后取樣進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，連接反應(yīng)同樣如此，條件都是沒問題的，都是固定的步驟，轉(zhuǎn)化的時(shí)候我在冰盒上溶解感受態(tài)到碎冰妝做的，之后嚴(yán)格按步驟進(jìn)行，該混合的時(shí)候也混合了，涂布時(shí)，混勻，吸取200ul涂布，每個(gè)板上取了5 個(gè)白色單菌落，可是都是空載，到底什么問題，我的基因GC含量比較高，TA克隆是不是都該做出來，是我傻才做不出來？求指點(diǎn)，可以問更具體的 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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woshishui916
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加A之后得純化的，要不直接連，空載很多的 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
5樓2019-09-26 14:43:38
xipha
木蟲 (正式寫手)
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注意事項(xiàng) 1. 在進(jìn)行克隆時(shí)，Vector DNA和Insert DNA的摩爾比一般為：1: 2～10。在本制品中，pMD18-T Vector 1 μl (50 ng) 的摩爾數(shù)約為0.03 pmol，Control Insert DNA 1μl (50 ng) 的摩爾數(shù)約為0.15 pmol。 2. 克隆時(shí)使用的Insert DNA片段 (PCR 產(chǎn)物) 盡量進(jìn)行切膠回收純化，PCR產(chǎn)物中的短片段 DNA(甚至是電泳也無法確認(rèn)的非特異性小片段)、殘存引物等雜質(zhì)都會影響TA克隆的效率。 3. 按照本實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行連接后，直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)的連接液不要超過20 μl。 4. 連接反應(yīng)請?jiān)?6℃下進(jìn)行，溫度升高 (>26℃) 較難形成環(huán)狀DNA。 5. 連接效率偏低時(shí)，可適當(dāng)延長連接時(shí)間至數(shù)小時(shí)。 6. 當(dāng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的DNA用量較大或準(zhǔn)備進(jìn)行電轉(zhuǎn)化時(shí)，需對連接液進(jìn)行乙醇沉淀精制DNA后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 |
2樓2019-09-26 10:04:54
3樓2019-09-26 11:32:55
安靜de執(zhí)著14
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轉(zhuǎn)化完培養(yǎng)后，離心去掉大部分上清，把所有的菌液進(jìn)行涂布；把平板上長出的單菌落都挑出來進(jìn)行PCR驗(yàn)證，如果你操作沒錯(cuò)的話，就算空載體多，肯定會有重組載體的。如果空載體真的特別多，那么你在酶切載體的時(shí)候，就需要適量增加酶量或者延長酶切時(shí)間。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
4樓2019-09-26 11:49:06
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