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小千100新蟲 (小有名氣)
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[求助]
同源重組多片段連接做不出來，我想重新做但又不知道是哪里操作的問題，怎么改進? 已有3人參與
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使用的是諾維贊多片段連接試劑盒，引物用公司的在線軟件設計的。載體8000多bp，三個片段分別1019，381，250多。 1.載體用takara快切酶雙酶切30min，切膠回收，目的片段分別以之前的2個T載體擴增，一個質粒擴增，切膠回收。 2.分別稀釋跑膠估算載體、三個片段濃度，按片段長度計算大致每個片段需要多少ng，加入多少μl 3.按說明書分別加入4μl載體，三個片段2μl，1μl，1μl，酶和buffer分別2μl，4μl，總體積20μl。37度反應30min。 4.10μl重組產物轉化100μl大腸桿菌感受態(tài)，過夜培養(yǎng)挑單菌落（比較少） 5.挑了9個單菌落搖菌提了質粒，雙酶切都沒有切出片段。 6.同時我做了兩個陰性對照1和2，都長了很多單菌落。1是只加了載體4μl，加水至20μl.2是只加了三個片段，加水至20μl. @wizardfan @youlinglyw @biostar2009 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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嗯嗯，也有同學推薦我那么做，后面我重新這樣操作連接成功了。陰性對照1是只加了線性化載體，長單菌落可能是我沒有切開；陰性對照2只加片段長菌可能是我其中一個片段用的擴增模板殘留了，那個質粒模板具有相同抗性。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
7樓2019-08-06 19:09:57
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2樓2019-07-24 10:02:34
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3樓2019-07-24 12:13:01
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4樓2019-07-27 18:40:00
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