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Pacbio iso-seq全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序tips
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近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已經(jīng)成為研究基因表達(dá)調(diào)控的主要手段。但二代的轉(zhuǎn)錄本重構(gòu)準(zhǔn)確率很低，三代可以直接得到全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，無需組裝�？筛纳苹虮磉_(dá)定量結(jié)果，發(fā)現(xiàn)新的基因和轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，鑒定可變剪切及基因融合現(xiàn)象。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已經(jīng)越來越多地被應(yīng)用到基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究中，以下整理了一些關(guān)于pacbio iso-seq 實(shí)驗(yàn)相關(guān)問答： 1，iso-seq 的建庫類型有哪些？ 目前三代 iso-seq 的建庫過程涉及到對(duì) 4kb 以下和 4kb 以上的片段分別進(jìn)行篩選,然后將 4kb以上和 4kb 以下的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行混合構(gòu)建 1 個(gè)三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組文庫，這也是目前 pacbio 官方推薦的主流建庫方式。 2. 如果我構(gòu)建兩個(gè)文庫，是一個(gè)庫生成一個(gè)文件嗎？還是混合文件？ 三代測(cè)序是一個(gè) cell 對(duì)應(yīng)一套測(cè)序結(jié)果文件，每個(gè) cell 都有單獨(dú)的結(jié)果文件，如果兩個(gè)庫分別測(cè)序，則是一個(gè)庫一個(gè)文件。 3. 三代的數(shù)據(jù)能不能拆分？ 三代測(cè)序支持混樣測(cè)序（加 barcode 方案），但目前在全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中應(yīng)用不多，因?yàn)槿旧硪粋�(gè) cell 的產(chǎn)量在 6~10gb 左右，剛好適用于一個(gè)樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)量沒必要進(jìn)行混樣測(cè)序。另外目前混樣測(cè)序數(shù)據(jù)拆分比例不高（60%左右）會(huì)造成數(shù)據(jù)量的浪費(fèi)。 4，pacbio iso-seq可以做轉(zhuǎn)錄本定量嗎？ pacbio iso-seq 對(duì)每個(gè)樣本通過構(gòu)建多個(gè)不同片段長(zhǎng)度的文庫，對(duì)每個(gè)片段的文庫也測(cè)了不同的深度，最終每個(gè)文庫進(jìn)行合并分析，因此就比較困難像二代測(cè)序一樣對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化來評(píng)估表達(dá)水平的rpkm/fpkm。 5. 如何選擇測(cè)序樣品？ 總體原則是根據(jù)研究目的進(jìn)行選擇：如果是希望獲得盡可能全面的轉(zhuǎn)錄本，換句話說，就是想要獲得該物種轉(zhuǎn)錄組水平的參考序列信息；那么我們建議對(duì)該物種的不同部位混合取樣。如果只想研究某個(gè)特定的組織部位，那么建議在不同發(fā)育時(shí)期對(duì)特定組織部位進(jìn)行取樣。 6. 如何確定測(cè)序的數(shù)據(jù)量？ 數(shù)據(jù)量大小依據(jù)物種的復(fù)雜程度、基因大小及研究目的來確定。根據(jù)已有的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)、數(shù)據(jù)庫信息及文章報(bào)道，我們推薦：普通動(dòng)植物，研究中、高豐度的轉(zhuǎn)錄本，測(cè)序量8g及以上（單個(gè)樣本測(cè)8g，構(gòu)建3個(gè)文庫）；多倍體、高雜合的基因組較大的物種，研究中、高豐度的轉(zhuǎn)錄本，測(cè)序量16g及以上；檢測(cè)低豐度的轉(zhuǎn)錄本，測(cè)序量20g以上。 注：混合樣品要相應(yīng)增加測(cè)序量，如果所研究物種有參考信息，可根據(jù)參考序列信息進(jìn)行個(gè)性化評(píng)估，推薦測(cè)序數(shù)據(jù)量及構(gòu)建文庫個(gè)數(shù)。 [ Last edited by 小冀- on 2019-7-24 at 09:26 ] |
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生物小蟲007(金幣+1): 謝謝參與
nono20093樓
2019-07-26 13:47
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生物小蟲007(金幣+1): 謝謝參與
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youngen4樓
2019-07-27 11:20
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生物小蟲007(金幣+1): 謝謝參與
youngen5樓
2019-07-27 11:21
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muzi01046樓
2019-07-30 07:39
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生物小蟲007(金幣+1): 謝謝參與
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