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魯班揍墨子新蟲 (初入文壇)
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[求助]
克雷伯氏菌基因敲除一直失敗 已有2人參與
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克雷伯氏菌敲除實(shí)驗(yàn) 最近一直失敗 決明子_c5iz 從六月十五號(hào)到七月初，半個(gè)月的時(shí)間。用crispcas9敲除克雷伯氏菌的基因一直失敗。 敲除步驟如下： 1.往lb培養(yǎng)基中加入kana抗生素，同時(shí)加入含有cas9質(zhì)粒的克雷伯氏菌過(guò)夜培養(yǎng) 2.第二天轉(zhuǎn)接二級(jí)種子，od等于0. 2時(shí)加入l型阿拉伯糖誘導(dǎo) 終濃度10mmol 培養(yǎng)到od等于0.4 ~0.6之間。放冰上半小時(shí) 3.四度離心，收集菌體。5000rpm 5min。用10%甘油洗三次，離心三次。 4.加入10%甘油1ml，吹打混勻，分裝到1.5ml離心管。加入1000ng的donor片段和120ng的sgrna質(zhì)粒。2500v 5ms電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)后立即加入lb培養(yǎng)基復(fù)蘇。30度后培養(yǎng)1h離心收集涂布kana和spe雙抗性板 5.第三天查看平板菌落生長(zhǎng)情況 挑選單菌落進(jìn)行pcr驗(yàn)證 當(dāng)前存在問(wèn)題： 4.收集菌體涂布平板 查看平板菌落生長(zhǎng)情況時(shí) 發(fā)現(xiàn)一直糊板 未發(fā)現(xiàn)單菌落 已經(jīng)更換阿拉伯糖 抗生素也重新配置 sgrna已經(jīng)更換四對(duì) 實(shí)在想不出原因 @天使托 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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prthefu
木蟲 (著名寫手)
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2樓2019-08-19 18:42:26
蝦蝦day
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3樓2020-07-01 00:40:34
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