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啊......，做WB好多雜帶，怎么辦？
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新抗體做wb，總在目的條帶附近出現(xiàn)非特異性條帶，百思不得其解？有童鞋看到雜帶，只懷疑抗體的原因，測完之后，您還認為——“非特異性”條帶一定是抗體的鍋嗎？ 當(dāng)然不是。對于cst的抗體，都是內(nèi)部研發(fā)生產(chǎn)并且經(jīng)過多重交叉驗證之后才提供給客戶的，cst盡全力保證出廠的抗體都具有高靈敏度、高特異性、高度可重復(fù)性。如果您用cst抗體出現(xiàn)多條非特異性條帶，除了考慮一抗的因素，您還需要考慮以下幾個因素： . 1 .原因：細胞系傳代次數(shù)過多，蛋白表達譜發(fā)生變化。 建議：使用未傳代或傳代次數(shù)較少的細胞系（不超過15代）進行樣品制備。 . 2 .原因：與細胞系裂解物相比，原代細胞或組織提取物會傾向于有較高的背景和降解條帶。 建議：1. 用新鮮提取的，經(jīng)過超聲處理的澄清的組織提取物能降低背景。2. 同時，用去垢劑含量較高的ripa buffer裂解組織，可得到裂解更徹底、一致性更高的裂解物。 . 3 .原因：蛋白被降解。 建議：1. 提取液確保含有蛋白酶抑制劑，并超聲；2. 蛋白樣品提取后分裝－20℃或－80℃短期保存，避免反復(fù)凍融，有條件盡量用新鮮提取的蛋白。 . 4 .原因：蛋白本身有很多修飾。 建議：查閱文獻，確定目的蛋白是否存在多種修飾，泛素化、糖基化等修飾會讓蛋白的條帶發(fā)生較大的偏移。 . 5 .原因：所檢測蛋白存在多種剪接體，導(dǎo)致分子量大小不同。 建議：查閱文獻或者通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼mrna。 . 6 .原因：蛋白存在二聚體或多聚體。 建議：sds loading buffer中現(xiàn)用現(xiàn)加β－巰基乙醇或dtt。 . 7 .原因：樣本存在外源轉(zhuǎn)入蛋白。 建議：檢查所用樣本是否有過被外源進去帶有標(biāo)簽的靶標(biāo)蛋白。如有，更換細胞系樣本。 . 8 .原因：上樣量過多。 建議：根據(jù)靶標(biāo)表達情況，梯度上樣跑膠后選擇合適的上樣量，通常20-50μg即可。 . 9 .原因：實驗操作與cst推薦的步驟有較大出入。 建議：1. cst推薦封閉液用5%脫脂奶粉／tbst，室溫1h；2. 一抗稀釋液、稀釋比參考抗體說明書，推薦4℃過夜孵育；3. 二抗用5%脫脂奶粉／tbst稀釋，工作濃度切忌過高，室溫孵育1h；4. 要用1xtbst緩沖液充分洗滌。 我們通過兩個案例來具體分析下： 案例1:細胞系對結(jié)果影響非常大--來自某客戶技術(shù)咨詢 實驗條件：檢測靶標(biāo)phospho-akt (ser473)；使用抗體：cst #4060s phospho-akt (ser473) (d9e) xp® rabbit mab；細胞系：mcf7。 問題：出現(xiàn)非特異性條帶。phospho-akt (ser473)（綠色）檢測出2條帶，一條在預(yù)測分子量60kd左右，另外一條稍大，兩條bands強度差不多。紅色熒光為內(nèi)參蛋白β-tubulin。 圖1 引用自客戶技術(shù)咨詢案例（見附件圖1） 解決方案：建議客戶復(fù)蘇傳代較少的細胞，重新刺激、裂解之后，即得到了單一的條帶。 問題分析：akt激酶由3個分子量非常相近的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成：akt1, akt2和akt3。phospho-akt (ser473)正常情況下應(yīng)該只有1條帶，但在某些特定條件下，akt還可以發(fā)生糖基化、泛素化等修飾，從而造成蛋白大小發(fā)生改變。在這個案例的溝通中，我們發(fā)現(xiàn)客戶之前使用的細胞系傳代超過了25代，所以重新用較少代數(shù)的健康細胞，用了同樣的抗體，最終得到了單一條帶。 國內(nèi)許多實驗室細胞傳代并不嚴(yán)格記錄傳代次數(shù)，以至于很多老師使用的細胞自己也都不知道多少代，所以這些細胞系里蛋白表達譜是否發(fā)生變化，甚至這些細胞系是否有被其他細胞或支原體污染等問題也不得而知。因此，我們呼吁老師們重視細胞系的培養(yǎng)，定期排查細胞污染，控制傳代次數(shù)，只用健康的細胞，確保實驗可靠。 ☞ 關(guān)于支原體污染對蛋白條帶的影響，推薦閱讀我主頁另一篇文章：《養(yǎng)細胞，做wb不知道這點？一開始你就輸了！》 這個有意思的案例起源于生命科學(xué)聯(lián)合中心、北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究所尹玉新教授課題組2017年的一篇發(fā)表在nature communications上的文章。作者先用全長的pten抗體檢測到一個比ptenα稍小的“雜帶”，同時“雜帶”的表達模式與ptenα類似(圖2.a)。如果作者認定這個“雜帶”是抗體非特異性識別，不進行下面的深入研究，那就沒有這篇大文章了。 當(dāng)時，作者在探究精神激勵下，又用只識別pten c-terminal domain的cst抗體 #9559 pten (138g6) rabbit mab（圖2.b）和識別n端的ptenα抗體（圖2.c）在不同的癌癥細胞系中檢測，加上后續(xù)一系列分析和質(zhì)譜驗證，證實最開始看到的那條“雜帶”是和ptenα類似的n-terminal extended pten isoform，后命名為ptenb，從而使人們對pten蛋白家族及其功能的多樣性有了更深刻的認識。 案例2:檢測到非特異性條帶還可能會發(fā)cns？--來自真實客戶案例 圖2、 a~c引用自尹玉新教授課題組nat. commun. 8, 14771文章的figure 1. ,d來自網(wǎng)絡(luò)圖片。（見附件圖2） 注：在b圖中可以看到，pten-null的pc3細胞系中抗體并沒有任何條帶，證實其他細胞系中得到的pten條帶是特異的 如果一個蛋白有多個isoforms，或蛋白同時發(fā)生多種翻譯后修飾（ptm），理論上只要cst抗體的抗原表位識別的區(qū)域在這些isoform或ptm的上面，并且蛋白的表達量達到可檢測水平，抗體都是能夠識別到的。這是cst抗體性能優(yōu)異的證明。 看來，如果您發(fā)現(xiàn)使用cst抗體檢測到“非特異性條帶”，先進行以下排查： 細胞樣本：有沒有被污染，有沒有傳代過久；組織樣本：存儲時間和條件是否得當(dāng)，有沒有發(fā)生降解。 樣本提取：是否新鮮提取，是否加蛋白酶/磷酸酶抑制劑，是否超聲。 有沒有嚴(yán)格按照網(wǎng)站上產(chǎn)品頁面提供的實驗步驟進行實驗操作。 查詢數(shù)據(jù)庫確認：靶標(biāo)蛋白是否有多種isoforms、影響蛋白大小的蛋白翻譯后修飾或容易出現(xiàn)多聚體等情況。 最后，祝大家好運！ 【參考文獻】 1.liang, h. et al. ptenβ is an alternatively translated isoform of pten that regulates rdna transcription. nat. commun. 8, 14771 doi: 10.1038/ncomms14771 (2017) |
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