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造成western-blot發(fā)光時發(fā)生熒光淬滅的因素有哪些？
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熒光淬滅是Western Blot發(fā)光時常見的現(xiàn)象，即加ECL發(fā)光液后立刻可以看到很明顯的亮光，但亮光很快就消逝了，壓完片后條帶卻很弱，甚至沒有條帶，發(fā)生這種情況的原因可能有以下幾個方面: 1. 抗體濃度太高，局部過多的HRP會快速消耗底物，導(dǎo)致熒光信號過強，條帶呈灼燒樣。可降低抗體上樣量。 2. 抗體濃度太低，熒光信號太弱，可能第一次壓片能夠獲得很弱的條帶，再壓片就沒有什么條帶都沒有。 3. 操作時間過長，膜逐漸干掉。避免膜干掉。 4. 不良的實驗習(xí)慣導(dǎo)致設(shè)備或試劑污染。例如鐵銹和不慎沾染的顯影液、定影液，會造成熒光淬滅，甚至直接導(dǎo)致無熒光； 5.ECL發(fā)光液的質(zhì)量。除過氧化物因接觸空氣被逐漸還原外，ECL發(fā)光液的成分通常都不穩(wěn)定。建議選擇發(fā)光穩(wěn)定的試劑，如Enlight。 |
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