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證明膜蛋白具有方向性 已有1人參與
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怎么用胰酶消化法證明膜蛋白具有方向性？放射性同位素標(biāo)記法也可以證明膜蛋白具有方向性嗎？ @飛約瘋?cè)嗽?/u> 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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TullyMonster
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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胰酶消化法 - 實驗原理： - 胰蛋白酶是一種以游離Lys或Arg構(gòu)成的肽鍵為特異性位點，將蛋白質(zhì)水解為小分子肽的酶； - 膜蛋白可分為三種基本的類型：內(nèi)在蛋白、外在蛋白、脂錨定膜蛋白。 - 實驗步驟： - 將一組完整的細胞低滲處理，除去細胞內(nèi)含物，保留細胞膜，從中提取膜蛋白后用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)分離膜上各類蛋白質(zhì)，得到其條帶Ⅰ； - 將一組完整的細胞放入含有等滲濃度胰酶的溶液中，使胰酶僅消化完暴露在細胞膜外表面的蛋白質(zhì)。處理適當(dāng)時間后，將細胞轉(zhuǎn)入至不含胰酶的等滲液中清洗干凈，再將細胞低滲破裂，除去細胞內(nèi)含物，保留細胞膜，從中提取膜蛋白后，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)分離膜上各類蛋白質(zhì)，得到條帶Ⅱ； - 將一組完整的細胞低滲裂解后用胰酶處理適當(dāng)時間，洗凈胰酶后，保留細胞膜，并提取膜上蛋白質(zhì)，繼續(xù)用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分離膜上各類蛋白質(zhì)得到條帶Ⅲ； - 比較以上三步獲得的三個條帶： - 條帶Ⅰ可以大致估計膜蛋白質(zhì)的種類； - 條帶Ⅰ與條帶Ⅱ比較：條帶Ⅱ中，遷移長度幾乎不變的蛋白質(zhì)吸附或嵌于細胞膜內(nèi)表面；遷移長度明顯減小的蛋白質(zhì)貫穿整個膜或嵌于細胞膜外表面；條帶消失的蛋白質(zhì)，僅在膜外與脂分子或糖脂連接成脂錨釘?shù)哪さ鞍祝?br /> - 條帶Ⅲ與條帶Ⅰ和條帶Ⅱ比較：條帶Ⅲ中，遷移長度依舊不變的蛋白質(zhì)完全包被于膜內(nèi)(實際幾乎不存在)；條帶Ⅱ中遷移長度不變，而條帶Ⅲ中減小的蛋白質(zhì)嵌于膜的內(nèi)表面；條帶消失的蛋白質(zhì)僅通過弱相互作用吸附于膜內(nèi)。 - 實驗結(jié)論： 由上述分析的膜蛋白分布規(guī)律可知，膜蛋白在細胞膜內(nèi)外表面及其上的分布狀態(tài)不一樣，體現(xiàn)了細胞膜蛋白的方向性。 —————————————————————————— —————————————————————————— 同位素標(biāo)記法 - 實驗原理 - 乳酸過氧化物酶能將碘標(biāo)記到暴露的蛋白質(zhì)Tyr殘基上； - 可通過放射性標(biāo)記，檢測被標(biāo)記了???I的蛋白質(zhì)的具體位置。 - 實驗步驟 - 將一組膜囊置于同時含有???I和乳酸過氧化物酶的溶液中，標(biāo)記暴露在膜外的蛋白質(zhì)； - 將一組膜囊在含有乳酸過氧化物酶的低滲溶液中長期培養(yǎng)，使乳酸過氧化物酶滲入膜囊內(nèi)。將其轉(zhuǎn)至含有???I的等滲溶液中，使???I進入膜囊內(nèi)，標(biāo)記內(nèi)膜表面上的蛋白質(zhì)； - 在電鏡下放射性檢測，觀察兩組樣品放射性強弱分布。 - 實驗結(jié)論 檢測到兩組樣品的放射性分布不同，證明細胞膜蛋白具有方向性。 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2019-03-25 00:44:56
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4樓2019-03-25 00:53:52
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