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我總結(jié)的western-blot實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)
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我做了很久的WB，最大的一個(gè)難點(diǎn)感覺在于樣品制備上！蛋白的降解有些時(shí)候是你想象不到的，可能出奇的糟糕，也可能完全沒事~~如果單獨(dú)做WB的話，感覺以“快速徹底裂解，先變性后保存”的原則比較有效，盡量選擇足夠強(qiáng)的裂解液，甚至直接給loading buffer裂解，然后取出部分蛋白定量，其余加入loading buffer100度充分變性，再分裝保存。有些時(shí)候比蛋白酶抑制劑更有效。 另一個(gè)感覺就是樣品中目的蛋白的量，限于WB的檢測下限問題，一般目的蛋白量最好別低于1ng（雖然ECL法下限是0.1ng，即100pg），最好在10ng以上為好。這就要求在做WB之前必須充分考慮目的蛋白的可能豐度，最好充分的準(zhǔn)備工作然后再設(shè)計(jì)細(xì)胞量或者組織量，千萬別把樣品搞稀了，否則就不好辦了。 還有一個(gè)就是顯影液的選擇。如果選擇了不合適的顯影液，就會造成背景高，靈敏度差，易淬滅，發(fā)光時(shí)間短等問題。建議選擇合適的顯影液。我用的是Enlight-plus這一款ECL發(fā)光液，超靈敏的，發(fā)光時(shí)間也挺長，最后出來的圖像很清晰。 最后，還是多看文獻(xiàn)，在做某個(gè)蛋白之前最好看看別人是如何做的，有什么特殊要求，內(nèi)參如何選等等。 |
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