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書(shū)畫(huà)江湖新蟲(chóng) (小有名氣)
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如何做好細(xì)胞電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)？
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要想做好細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： 1. 選擇合適的電場(chǎng)強(qiáng)度 合適的電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)于電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)非常重要，電場(chǎng)強(qiáng)度不能過(guò)高，過(guò)高會(huì)增加細(xì)胞的死亡率；也不能過(guò)低，過(guò)低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細(xì)胞系具有不同的最佳場(chǎng)強(qiáng)值，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)測(cè)定所轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的最佳電場(chǎng)強(qiáng)度。 2. 選擇合適的細(xì)胞 用于電轉(zhuǎn)的細(xì)胞一般選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（15代以內(nèi)，傳代后2d）。因?yàn)樘幱趯?duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分裂旺盛，表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細(xì)胞差，電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強(qiáng)，而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA. 3. 質(zhì)粒質(zhì)量要好 應(yīng)選擇純度高的質(zhì)粒，首先DNA／RNA應(yīng)該超純(A260／A280>1．8)，其次應(yīng)不含內(nèi)毒 素，同時(shí)質(zhì)粒應(yīng)溶于雙蒸水而不是TE緩沖溶液。另外，DNA濃度不宜過(guò)高。 4. 選擇合適的電轉(zhuǎn)染試劑 電擊會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定程度的傷害，在轉(zhuǎn)染試劑的選擇上要注意，應(yīng)選擇具有細(xì)胞膜修復(fù)成分的電轉(zhuǎn)染試劑，如Entranster-E，可將電擊對(duì)細(xì)胞的損傷降到最低。并且，Entranster-E可適用于lonza、Bio-rad、BTX等多種電轉(zhuǎn)儀。 |
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