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[求助]
分子克隆
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最近一直在做分子克隆，線性化載體連接轉(zhuǎn)化，根據(jù)neb推薦的各種摩爾比做的連接體系，單菌落是長出來了，可是酶切驗證一直是自連，用的是psuper載體，一個月了還沒有構(gòu)建出來，求各位大神指教 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
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多細(xì)胞11
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- 注冊: 2015-04-20
- 專業(yè): 微生物遺傳育種學(xué)
3樓2019-03-01 09:59:34
多細(xì)胞11
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snoopytbw: 金幣+3, 鼓勵 2019-03-01 10:52:56
snoopytbw: 金幣+3, 鼓勵 2019-03-01 10:52:56
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首先確保酶切位點(diǎn)對，并且空載體酶切位點(diǎn)未突變(可以空載體測序驗證，當(dāng)然即使測序?qū)α艘膊灰欢苡茫锌赡苊盖形稽c(diǎn)被甲基化等表觀遺傳學(xué)修飾，導(dǎo)致切不開)，適當(dāng)降低載體濃度，確保大多數(shù)載體都能以雙酶切的形式切開，并適當(dāng)延長酶切時間。具體的可以參考文獻(xiàn)Why Johnny can't clone: Common pitfalls and not so common solutions.當(dāng)然可能看了逐步驗證還是連不上，挑不到正確的克隆。推薦個人常用方法直接根據(jù)載體雙酶切位點(diǎn)設(shè)計兩個引物，直接P質(zhì)粒，然后雙酶加Dpn1三酶酶切，目的片段雙酶切，然后按1:3-10酶連即可。載體模板至少要單酶切(防止P出來的載體還是環(huán)狀的，比如我用的Phusion酶，如果不切就是) 發(fā)自小木蟲Android客戶端 |
2樓2019-03-01 09:57:58
4樓2019-03-01 22:39:53
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