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懸浮細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟 已有1人參與
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懸浮細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染操作步驟，以24孔板siRNA轉(zhuǎn)染為例 1.提前1天細(xì)胞種植 懸浮細(xì)胞：采用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，數(shù)量為常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的1/3進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。如某細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)是6×105，那么就用2×105的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 2.轉(zhuǎn)染過程 ⑴取0.67ug(50pmol)的siRNA，加入一定量無血清稀釋液，充分混勻，制成RNA稀釋液，終體積為25μl。 注意：無血清稀釋液建議采用OPTI-MEM、無血清DMEM或1640。 ⑵取1ul的Entranster-R4000，然后加入24ul無血清稀釋液體，充分混勻，制成Entranster-R4000稀釋液，終體積為25μl。室溫靜置5分鐘。 ⑶將Entranster-R4000稀釋液和RNA稀釋液充分混合（可用振蕩器振蕩或用加樣器吹吸10次以上）混合，室溫靜置15分鐘。轉(zhuǎn)染復(fù)合物制備完成。 ⑷將50μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到有0.45ml全培養(yǎng)基（可含10%血清和抗生素）的細(xì)胞上，前后移動(dòng)培養(yǎng)皿，混合均勻。 注意：對(duì)本試劑，采用含血清的全培養(yǎng)基有助于提升轉(zhuǎn)染效率。 ⑸轉(zhuǎn)染后6小時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)，如狀態(tài)良好可不必更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-96小時(shí)得到結(jié)果。 注意：1.siRNA轉(zhuǎn)染后，繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時(shí)在mRNA水平得到結(jié)果，繼續(xù)培養(yǎng)24-96小時(shí)在蛋白水平得到結(jié)果。mRNA轉(zhuǎn)染后，根據(jù)需要在24小時(shí)后得到結(jié)果。 2.在部分實(shí)驗(yàn)室，由于血清和培養(yǎng)條件等差異，轉(zhuǎn)染后鏡下培養(yǎng)基中可能出現(xiàn)少量黑點(diǎn)狀沉淀，為轉(zhuǎn)染試劑和血清中蛋白結(jié)合產(chǎn)物，不影響轉(zhuǎn)染結(jié)果和細(xì)胞狀態(tài)，可通過換液除去。 |
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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
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| 細(xì)胞的狀態(tài)是整個(gè)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的重要因素，一方面細(xì)胞狀態(tài)必須要好，同時(shí)轉(zhuǎn)染的條件也需要優(yōu)化。我們實(shí)驗(yàn)室剛開始做HL60細(xì)胞轉(zhuǎn)染的時(shí)候用Lipo發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性有點(diǎn)大，聽了其他實(shí)驗(yàn)室同學(xué)的介紹換了RFect，用下來飄起來的細(xì)胞不多，整個(gè)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過程中也沒有換液 |
2樓2019-10-23 10:53:12
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