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如何解決細胞培養(yǎng)中的支原體污染？
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一說起支原體，估計細胞培養(yǎng)的人員就開始手心冒汗了。細胞培養(yǎng)中的急性污染往往容易察覺，而支原體則像慢性毒藥一般，殺細胞于無形中。除了非常有經(jīng)驗的老手，很多實驗人員都察覺不到支原體的污染。據(jù)統(tǒng)計，超過25%的細胞系中感染了支原體，而研究者大多并不知曉。早期，血清可能是主要的污染源；之后，通過實驗室的儀器、培養(yǎng)基或其他試劑漸漸蔓延開來，細胞無不中招。怎樣才能根除討厭的支原體污染呢？ 支原體生長緩慢，通常不破壞宿主細胞。然而，它們能以許多不同方式改變細胞的新陳代謝。細胞除了長得不好之外，幾乎所有的實驗表現(xiàn)如蛋白表達也都會受到影響。傳統(tǒng)的抗生素對支原體并不奏效，因為它們大多破壞細胞壁的完整性，而支原體恰恰沒有細胞壁。這也就是支原體感染率高的主要原因。曾有一位細胞培養(yǎng)專家戲稱：“我可是支原體方面的專家，并不是因為我喜歡他們，而是25-60%的細胞系都感染了支原體�！敝гw總在偷偷地改變細胞，篡改我們的實驗數(shù)據(jù)。怎么辦？ 檢測、檢測、再檢測 對培養(yǎng)物進行常規(guī)的支原體檢測非常重要。盡管各個實驗室的檢測頻率不同，從幾個星期到幾個月不等，不過這主要取決于你們實驗室有多少人接觸細胞，以及你們引進新細胞的頻率。比如美國國立細胞培養(yǎng)中心（NCCC），它經(jīng)常從其他實驗室獲得細胞培養(yǎng)物，就會對每個樣品進行檢測，并將它們隔離，直至最后證明無支原體污染。一般來說，每兩三個月進行一次定期檢測是必要的。如果有新細胞進入實驗室，或準備將細胞進行液氮保存，都應(yīng)該進行檢測。當然，如果細胞不大對勁，應(yīng)立馬檢測。 檢測頻率是一方面，選擇合適的檢測方法也很重要。到底是PCR、生化分析、ELISA還是免疫熒光呢？PCR應(yīng)該算是檢測支原體的理想方法，它綜合了幾個優(yōu)勢：靈敏、特異、快速、廉價等。細胞培養(yǎng)上清可直接用來檢測，非常方便。Sigma-Aldrich公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit，擴增的就是支原體基因組上16S核糖體RNA基因。此區(qū)域高度保守，因此可檢測多達19種支原體。當然，為了避免假陽性和假陰性，實驗中必須設(shè)立多種對照：陽性對照、陰性對照和內(nèi)對照。如果電泳圖上出現(xiàn)259bp的清晰條帶，對不起，你中招了。以色列Biological Industries（BioInd）公司的EZ-PCR Mycoplasma Test Kit也能提供支原體的快速檢測，引物與Sigma類似，也是擴增16S rRNA。這個試劑盒的靈敏度頗高，M. capricolum的檢測極限為5.5 CFU/ml，M. hyorhinis則為10.5 CFU/ml。 Stratagene新的MycoSensor QPCR Assay Kit通過實時定量PCR的方法來檢測最低10個拷貝的支原體，連跑膠的時間都省了，整個過程只需要2小時。陽性PCR產(chǎn)物的Tm值為85C，而內(nèi)對照為82C，通過熔解曲線分析能將兩者區(qū)分開。另外，Stratagene也提供了PCR檢測支原體的試劑盒。 如果你對雜交過程得心應(yīng)手，還可以選擇R&D公司的MycoProbe Mycoplasma Detection Kit。它利用標記了堿性磷酸酶的寡核苷酸探針與16S 核糖體RNA雜交，隨后用顯色底物就能了解支原體的存在。整個過程只需4.5小時，也還算快，能檢測8種最常見的支原體。 用Hoechst 33258染料檢測支原體是很多教科書推薦的方法。由于支原體含有DNA，能與Hoechst 33258染料結(jié)合，在500倍放大情況下，表現(xiàn)為細小顆�；蚶w毛染色。但操作過程較繁瑣，且需要一定的經(jīng)驗來辨別支原體，新手可能不大容易掌握。 特別值得一提的是：最近筆者嘗試采用一種由我國蘇州先達基因公司研發(fā)的支原體試劑盒，其原理是基于公司自主開發(fā)的實時熒光恒溫核酸檢測技術(shù)（ERA），可以在恒定的低溫下（25℃-42℃）對痕量的支原體種內(nèi)保守性DNA片段進行特異性的擴增，擴增反應(yīng)可以在20min內(nèi)完成，該試劑盒檢測范圍涵蓋130種支原體，靈敏度也比較高，是普通PCR的10-1000倍，操作簡便。 不過，預防支原體的最佳方法還是良好的細胞培養(yǎng)技巧和正確的態(tài)度。雖然這些都是老生常談，但一旦熟悉了細胞培養(yǎng)，就很容易麻痹大意，時常敲敲警鐘還是相當必要的。 |
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